网站导航

技术文章

当前位置:主页 > 技术文章 > 谷胱甘肽还原酶(GR)说明书8

谷胱甘肽还原酶(GR)说明书8

更新时间:2017-08-28 点击次数:1575

 

谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)说明书

 

分光光度法 50 /48

 

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

 

测定意义:

 

GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶,是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一(通常昆虫中 GR  TrxR 取代)。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH,有助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用,此外 GR 还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。

 

测定原理:

 

GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH,同时 NADPH 脱氢生成 NADP+NADPH  340 nm 有特征吸收峰,相反 NADP+在该波长无吸收峰;通过测定 340 nm 吸光度下降速率来测

 

定 NADPH 脱氢速率,从而计算 GR 活性。

 

自备仪器和用品:

 

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水

 

试剂组成和配置:

 

试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

 

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 5.0 mL 蒸馏水,混匀。

 

试剂三:液体 3mL×1 支,4℃保存。

 

粗酶液提取:

 

1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。

 

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g4℃,离心 15min,取上清置于冰上待测。

 

3. 血清等液体:直接测定。

 

操作步骤:

 

1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。

 

2. 试剂一置于 25℃(普通物质)或者 37℃(哺乳动物)中预热 30min

 

3. 测定管:取 1mL 石英比色皿,依次加入 50μL 试剂三,100μL 试剂二, 750μL 试剂一,

 

100μL 上清液迅速混匀, 340nm 测定 10 s  190 s 吸光度,记为 A  1  A  2A

 

测定管= A  1A  2(注意加完上清液后迅速混匀测定)

 

计算公式:

 

(1). 按蛋白浓度计算

 

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0 条件下,每毫克蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷[Cpr×V ]÷T

= 536×A 测定管÷Cpr

 

(2). 按样本质量计算

 

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0 条件下,每克样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为

 

个酶活单位。

 

GR 酶活(nmol/min/g 鲜重)= [ A 测定管÷ε÷d×V 反总×109] ÷(W×V ÷V 样总)÷T = 536×A 测定管÷W

 

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0 条件下,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/104 cell)= [ A 测定管÷ε÷d×V 反总×109] ÷(细胞数量×V ÷V 样总)÷T

 

536×A 测定管÷细胞数量

 

4)按液体体积计算

 

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0 条件下,每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mL)= [ A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷×V ÷T

= 536×A 测定管

 

εNADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cmV 反总:反应体系总体积,1000μL=0.001 L

 

1061 mol=1×106μmol Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);V 样:加入反应体系中上清液体积,100μL =0.1 mLV 样总:加入提取液体积,1mLW,样本质量,gT:反应时间,

 

min

 

注意事项:

 

1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融;(2)试剂二须现配现用,配制完后,置于冰上,未使用完的 4℃保存,三天内使用完。(3测定前须先用 12 个样做预实验,哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 25 倍。

 

4)细胞中 GR 活性测定时,细胞数目须在 300 -500 万之间,细胞中 GR 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。

 

联系方式

邮件:jskangchina@163.com
地址:山东青岛市青大工业园韩海路
微信扫描关注我们
在线客服 联系方式 二维码

服务热线

0532-58720157 0532-58967204

扫一扫,关注我们