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Technical articles使用说明书
检测原理
试剂盒采用双抗一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被多杀性巴氏杆菌抗体微孔中,依次加入标本、HRP标记的检测抗原,经过温育并*洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD 值),与CUT OFF值相比较,从而判定标本中多杀性巴氏杆菌(PTM)的存在与否。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3. 细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5. 保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
操作注意事项
试剂盒组成
名称 | 96孔配置 | 48孔配置 | 备注 |
微孔酶标板 | 12孔×8条 | 12孔×4条 | 无 |
阴性对照 | 0.5mL | 0.5mL | 无 |
阳性对照 | 0.5mL | 0.5mL | 无 |
检测抗原-HRP | 10mL | 5mL | 无 |
20×洗涤缓冲液 | 25mL | 15mL | 按说明书进行稀释 |
样本稀释液 | 6mL | 3mL | 无 |
底物A | 6mL | 3mL | 无 |
底物B | 6mL | 3mL | 无 |
终止液 | 6mL | 3mL | 无 |
封板膜 | 2张 | 2张 | 无 |
说明书 | 1份 | 1份 | 无 |
自封袋 | 1个 | 1个 | 无 |
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法
操作步骤
4.随后阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗原100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
1. 试验有效性:阳性对照孔OD值平均值≥1.00;
阴性对照孔OD值平均值≤0.15。
2. 临界值(Cut off)计算:临界值=阴性对照孔平均值+0.15
3. 阴性判断:样品OD值<临界值(Cut off),样品为阴性
4. 阳性判断:样品OD值>临界值(Cut off),样品为阳性
试剂盒性能
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