网站导航

技术文章

当前位置:主页 > 技术文章 > His标签蛋白纯化预装柱

His标签蛋白纯化预装柱

更新时间:2020-04-03 点击次数:1744

中文名称:His标签蛋白纯化预装柱

英文名称:Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5ML

产品规格:5ml|1ml

Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外,因其基质的耐压性(该基质可以耐受高0.3 MPa的压力),该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化,可在相对较高的流速下,实现对目的蛋白的纯化。

Ni-NTA 6FF Chromatography Column是一种以Ni-NTA Agarose Resin 6FF为填料的中压预装柱,该预装柱具有标准接口,可以适配商品化的各类中压色谱系统,如ÄKTA等,方便客户用于纯化His-tag蛋白。

基质(Matrix):高度交联的6%琼脂糖凝胶
孔径(Bead size):45-165µm
载量(Capacity):>40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压(Tolerance Pressuremax):0.3MPa, 3bar
储存缓冲液:含20%乙醇的1×PBS
柱子尺寸(Column Size):0.7×2.5cm(1ml)
储存条件:4℃保存,有效期2年

注意事项
1)建议纯化所用缓冲液和蛋白溶液经0.22µm或0.45µm滤膜过滤后上柱使用。
2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法
(一)纯化流程

1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。Buffer 在使用前用0.22µm或0.45µm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。

2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达蛋白为例)
1)挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2)表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体,然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSF(PMSF在破碎前加入,其终浓度为1mM),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3)之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1mg/ml。【注】:如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE,可以不加入溶菌酶。
4)将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。
5)收集上述澄清蛋白液,10000rpm,4℃离心20-30min。取上清,0.22µm/0.45µm滤膜过滤后,置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶,5000rpm离心10min,收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等,即可直接上柱纯化;如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】:对于大量体积的上清,需加入硫酸铵进行沉淀浓缩,之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)
1)将培养液转移至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体去上清。
2)按照菌体:裂解液=1:10(w/v)的比例将菌体充分悬浮,混匀,冰浴超声破碎。
3)将破碎液转移至离心管,10000rpm,4℃离心20-30min,去上清。可重复步骤2)和3)一次。
4)按照菌体:裂解液(含8M尿素)=1:10(w/v)的比例将包涵体充分悬浮。
5)变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3 样品纯化(以AKTA使用为例)
1)将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞,连接至色谱系统中,再折断下口,将预装柱连接到色谱系统中,注意旋紧。
2)3-5倍柱体积去离子水冲洗出存储缓冲液。
3)至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。推荐流速为5ml/min。
4)利用泵或注射器上样。【注】:若样品粘度增加,即使上样体积很少也会导致层析柱很大的反压;上样量不要超过柱子的结合能力;大量的样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器更难使用。
5)Wash Buffer 平衡柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。【注】:在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6)Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度,例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
7)建议用更高浓度咪唑(如500mM)*清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂,后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。

4 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。

(二)在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高(>0.5Mpa)或者填料上面出现明显的污染时,需对其进行在位清洗(Cleaning-in-Place,CIP)。在位清洗时,先把Ni2+脱掉,清洗结束后,将填料保存在20%乙醇中,后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
1 去除强疏水结合的蛋白,脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积,接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液,接触时间为1-2h。去污剂处理后,需用70%的乙醇清洗5倍柱体积,*去除去污剂。后利用去离子水清洗10倍柱体积。
2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min,之后用去离子水清洗10倍柱体积。

(三)填料再生
当填料使用过程中发现反压过高(>0.5Mpa),填料上面出现明显的污染,或填料载量明显变低时,需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理,即填料再生。按照下面操作流程进行:
1)使用0.2M 醋酸溶液(含6M GuHCl)清洗2倍柱体积;
2)去离子水清洗5倍柱体积;
3)2%SDS清洗3倍柱体积;
4)去离子水清洗5倍柱体积;
5)乙醇清洗5倍柱体积;
6)去离子水清洗5倍柱体积;
7)100mM EDTA(pH 8.0)清洗5倍柱体积;
8)去离子水清洗5倍柱体积;
9)100mM NiSO4清洗5倍柱体积;
10)去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后,可立即使用,也可保存在20%乙醇中,置于4℃备用。

联系方式

邮件:jskangchina@163.com
地址:山东青岛市青大工业园韩海路
微信扫描关注我们
在线客服 联系方式 二维码

服务热线

0532-58720157 0532-58967204

扫一扫,关注我们