牛结核病（TB）酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于检测牛血清，血浆及相关液体样本中结核病（TB）水平。

实验原理：

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中结核病（TB）。用纯化的牛结核病（TB）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中结核病（TB）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与 HRP 标记的结核病（TB）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成终的黄色。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），与 CUTOFF 值相比较，从而判定标本中牛结核病（TB）的存在与否。

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。​

结果判定：

试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.20

临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15

阴性判定：样品 OD 值< 临界值（CUT OFF）者为结核病（TB）阴性

阳性判定：样品 OD 值≥ 临界值（CUT OFF）者为结核病（TB）阳性

注意事项

1. 操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。

2. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

3. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

4. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5. 底物请避光保存。

6. 试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为 630nm

7. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为 2M 的硫酸，使用时必须注意安全。

保存条件及有效期

1. 试剂盒保存：；2-8℃。

2. 有效期：6 个月