石蜡切片TUNEL测定试剂盒产品说明书

主要用途

石蜡切片TUNEL测定试剂是一种旨在使用标准化的化学方法，包括石蜡分离、无热性酶消解等完整步骤，从存档中的石蜡包埋的组织切片中探寻DNA断点，即运用修饰过的核苷酸，在末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）的帮助下，对DNA单链或双链上断点处的3’末端进行标记，原位探测和定量分析单细胞水平的DNA降解状况的经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于石蜡包埋组织切片的DNA降解测定。广泛用于细胞凋亡的研究。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定。

产品内容

去石蜡液（Reagent A）      150毫升

补水液A（Reagent B）  50毫升

补水液B（Reagent C）  50毫升

补水液C（Reagent D）  50毫升

补水液D（Reagent E）  50毫升

清理液（Reagent F）  60毫升

酶解液（Reagent G） 500微升

终止液（Reagent H） 500微升

酶标液（Reagent I） 500微升

染色液（Reagent J） 500微升

显色液A（Reagent K） 500微升

显色液B（Reagent L）   5毫升

强化液（Reagent M）       50微升

产品说明书   1份

保存方式

保存酶解液（Reagent G）、酶标液（Reagent I）、染色液（Reagent J）和显色液A（Reagent K）在－20℃冰箱里，严格避免反复冻融，其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent J）和显色液A（Reagent K），避免光照；有效保证6月

用户自备

小型染色缸：用于石蜡切片的去石蜡和染色操作

光学显微镜：用于细胞染色后观察分析

特别注意

1. 酶标液（Reagent G）不能在室温下冻融，而必须在冰槽里冻融，冻融后即刻使用；严禁反复冻融；考虑分装，以备下次使用
2. 显色液A（Reagent K）和显色液B（Reagent L）必须在实验操作前即刻混匀；混匀后切忌久放不用或储存后备用；用完扔掉
3. 显色液A（Reagent K）如果出现沉淀，须过滤后再用
4. 每次移取试剂，须更换枪头，以免污染母液，影响结果
5. 石蜡包埋前，组织切片须用1％多聚甲醛或常规固定液4℃条件下，固定16小时，否则组织易脱落

实验步骤

• 去石蜡处理
• 取出10片待测的石蜡包埋的组织切片（注意：石蜡包埋前，组织切片须用1％多聚甲醛4℃条件下，固定16小时，此步很重要）
• 放进80℃烘箱，孵育30分钟
• 室温下静置15分钟
• 按下表依次放进小染色缸里孵育

• 小心移去切片上的补水液D（Reagent E）
• 小心加上200微升清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面
• 室温下孵育5分钟
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

二、 蛋白消解处理

• 小心加上50微升酶解液（Reagent G），铺满整个切片样品表面
• 室温下孵育15分钟
• 小心移去切片上的酶解液（Reagent G）
• 小心加上50微升终止液（Reagent H），铺满整个切片样品表面
• 室温下孵育5分钟
• 小心移去切片上的终止液（Reagent H）
• 室温下，将切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育5分钟
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）
• 断点标记处理
• 小心加上50微升含有酶标液（Reagent I），铺满整个切片样品表面
• 在37℃湿润的培养箱里，孵育1小时，保持湿润，避免干燥
• 小心移去切片上的酶标液（Reagent I）
• 室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育2分钟
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

四、 样本染色处理

在染色前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的显色液A（Reagent K）置入冰槽里融化，然后移取200微升显色液A（Reagent K）和1.8毫升显色液B（Reagent L）到2毫升离心管，再加入10微升强化液（Reagent M），充分混匀，标记为显色工作液，置于暗室。然后进行下列操作：

• 小心加上50微升染色液（Reagent J）在切片上，铺满整个切片样品表面
• 室温下孵育30分钟，避免光照
• 小心移去切片上的染色液（Reagent J）
• 室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育2分钟
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）
• 小心加上100微升含有显色液A（Reagent K）和显色液B（Reagent L）的显色工作液，铺满整个切片样品表面
• 室温下孵育5至30分钟，或直至样本出现棕褐色
• 小心移去切片上含有显色液A（Reagent K）和显色液B（Reagent L）的显色工作液
• 室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent F）中浸泡5秒
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）
• （选择步骤）进行甲基绿复染（注意：建议使用甲基绿复染试剂盒－GMS40010）
• 放上盖玻片或封片
• 即刻在一般光学显微镜下观察：阳性细胞呈现棕褐色

注意事项

• 本产品为10次操作
• 本产品为生物素标记，超过荧光素标记强度1000倍
• 本产品无需POD转换，直接在光学显微镜下观察，既方便，又确保信号不受影响
• 操作时须戴手套，以防污染
• 石蜡包埋前，组织切片须用1％多聚甲醛或常规固定液4℃条件下，固定16小时，否则造成样品支离破碎
• 酶标液（Reagent I）温度敏感，严禁反复冻融
• 清理液（Reagent F）50毫升置于小型染色缸里，可重复使用
• 所有操作在室温下进行，除酶标孵育外
• 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干。空气中晾干状态为没有水滴，呈湿润状态，可见反光
• 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面
• 细胞显色，避免过度，密切目测观察，控制时间
• 细胞显色完成后，即刻进行光学显微镜观察
• 本公司提供系列细胞凋亡试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定显色清晰