分光光度法 50 管/24 样

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

磷脂酶 A2（EC3.1.1.4）是磷脂 sn-2 位脂酰基水解酶，广泛存在于动植物组织、细菌、细胞核分泌物中，参与脂肪消化，精子成熟、细胞信号传递、脂质过氧化修复、宿主反应等生理过程，在控制体内磷脂类物质平衡、调节机体新陈代谢、参与疾病的病理进程等方面发挥着及其重要的作用。

测定原理

磷脂酶 A2 作用于 2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱（HEPC）产生游离巯基，与DTNB 反应生成黄色物质，在 412nm 处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、超速冷冻离心机、研钵、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿。

试剂组成和配制

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。试剂二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体×5 瓶，-20℃避光保存。临用前根据用量每瓶加入 4.5mL 试剂二充分混匀；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样品处理

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1  的比例（建议 500万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。

3. 血清：直接测定。

 测定操作 

磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）试剂盒计算公式

1. 按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △ A÷（ ×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T

= 73.53×△ A÷Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/g 鲜重）= △ A÷（ ×d）×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 73.53×△ A÷W

3. 细胞数量计算

酶活性定义：每 10⁴ 个细胞每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/10⁴ cell）= △ A÷（ ×d）×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T= 73.53×△ A÷细胞数量

4 按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2 活性（nmol/min/mL）= △ A÷（ ×d）×V 反总÷V 样÷T

= 73.53×△ A

：TNB 消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，1mL； V 样：反应体系中加入样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；V 样总：加入提取液体积，1mL； T：反应时间，10min