可见分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

规格：50T/48S

产品内容：

试剂一：液体 90mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。

试剂四：液体×1 支，-20℃避光保存。

产品说明：

TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似，催化 GSSG 还原生成 GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。

TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，但还原型谷胱甘肽与 DTNB 同样能反应生成 TNB，因此本试剂盒利用 2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型谷胱甘肽，通过测定 412nm 波长处 TNB 的增加速率，即可计算 TrxR 活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待检测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500  万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3 s，间隔7s，总时间3min）， 然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定前将上清液与试剂四以 50：1 的体积比混匀（即取 100μL 上清液加入 2μL 试剂四混合）37℃ 水浴 30min 后至冰上。

二、TrxR 测定操作：

1. 分光光度计预热 30 min 后，调节波长到 412nm，用蒸馏水调零。

2. 试剂一在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热 30min。

3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 试剂二，100μL 试剂三，800μL 试剂一，迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 时吸光度，然后将比色皿放入 37℃水浴 5min 后混匀立即测定 310 s 吸光度，记为 A1 和 A2。△A 空白管=A2-A1。

4. 测定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 试剂二，100μL 试剂三，700μL 试剂一，100μL 上清液，迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 时吸光度，然后将比色皿放入 37℃水浴 5min 后混匀立即测定 310 s

5. 吸光度，记为 A3 和 A4。△A 测定管=A4-A3。

三、TrxR 活性计算：

（1） 按蛋白浓度计算

活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol DTNB 还原为一个酶活力单位。

TrxR（U/mg prot）=（△A 测定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T

=0.147×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

活性单位（U）定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1μmol DTNB 还原为一个酶活力单位。

TrxR（U/g 鲜重）=（△A 测定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T

=0.147×（△A 测定管-△A 空白管）÷W

（3） 按细胞数量计算

活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每104 个细胞每分钟催化1μmol DTNB 还原为一个酶活力单位。

TrxR（U/104 cell）=（△A 测定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V样总)÷T

= 0.147×（△A 测定管-△A 空白管）÷细胞数量

ε：TNB 在 412nm 处的微摩尔消光系数，0.0136 L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总： 反应体系总体积（L），1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），100μL=0.1 mL；T：反应时间（min），5 min；W：样品鲜重，g； V 样总：提取液体积，1mL；细胞数量：以 104 为单位，以万计。

注意事项:测定前须先取 1～2 个样做预实验，使得吸光值在 5min 内程线性变化。哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时，一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右；测定过程操作须迅速。