组织基质金属蛋白酶13活性荧光定量检测试剂盒说明书

主要用途

    组织基质金属蛋白酶13（MMP13）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针MCA供体和DAP/DNP受体双重标记的多肽底物PChaGNvaHA，受到MMP13蛋白酶的水解，解离抑制基团，产生荧光产物，即采用荧光法来测定样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中基质金属蛋白酶13的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。

产品内容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

缓冲液（Reagent C）         毫升

底物液（Reagent D）         微升

标准液（Reagent E）              微升

产品说明书             1份

保存方式

保存底物液（Reagent D）和标准液（Reagent E）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应孵育

黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备

1． 手术取出动物组织，并秤重500毫克

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （选择步骤）抽去清理液

5． 移入到一个液氮冻存管

6． 即刻放进液氮罐过夜

7． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

8． 放进一个15毫升锥形离心管

9． 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 

10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12． 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g

13． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

15． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如组织裂解萃取液或纯化酶样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光酶标仪（温度为37℃）：激发波长330nm，散发波长400nm，间隔5分钟，读数6次（共30分钟）

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 标准样品配制

1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2． 分别加入xx微升缓冲液（Reagent C）到1至5号管

3． 移取xx微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀

4． 小心移取xx微升1号管稀释的标准液（Reagent E）到2号管，混匀

5． 小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent E）到3号管，混匀

6． 小心移取xx微升3号管稀释的标准液（Reagent E）到4号管，混匀

7． 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

四、荧光测定

1． 在黑色96孔板上做好相应标记：标准样品、样品活性

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到相应孔里

3． 分别加入20微升上述配制的标准液或待测样品（20微克纯化酶或100微克组织裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）

4． 放进37℃培养箱里孵育10分钟

5． 分别加入xx微升底物液（Reagent D）

6． 轻轻摇动黑色96孔板

7． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 标准样品实际荧光读数：标准样品值—背景对照值

9． 待测样品实际荧光读数：5分钟荧光读数—背景对照荧光读数

10． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位RFU；横座标（X轴）为标准甲氧基多肽浓度（微摩尔/升）

11． 根据标准曲线获得样品活性对应甲氧基多肽浓度（微摩尔/升）

五、计算样品活性

 注意事项

1． 本产品为25次操作，包括标准液

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准液测定只需1次

4． 样品须澄清，至关重要

5． 样品准备要点如下：

a) 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂

b) 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）

c) 如果样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂（建议使用胶原酶潜酶活化剂（APMA）－GMS12197）

6． 如果用户没有特定的滤波器，可以使用激发波长320至340nm之间的任一波长，散发波长390至420nm之间的任一波长

7． 测定值由低到高变化；通常测定持续5分钟，如果酶活性过低，可以持续测读30分钟

8． 荧光读数增加，表明具有酶活性

9． 待测样本为酶粗提样品，其蛋白浓度为20微克/20微升；待测样本为总蛋白，其蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）

10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11． 可以使用基质金属蛋白酶13抑制剂CL-82198作为抑制剂对照或阴性对照

12． 基质金属蛋白酶13活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1纳摩尔的多肽底物PChaGNvaHA

13． 本公司提供系列基质金属蛋白酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺"的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。