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恩诺沙星检测试剂盒(酶联免疫法)使用说明书

更新时间:2022-04-18 点击次数:687

 1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测蜂蜜、动物组织(鸡肉、猪肉、鱼、虾)、牛奶、奶粉和鸡蛋等样本中的恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR),试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时,加入标准品或样品溶液,样本中的恩诺沙星和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗恩诺沙星抗体,加入酶标记物后,用TMB底物显色,样本吸光度值与其所含恩诺沙星含量成负相关,与标准曲线比较即可得出样本中恩诺沙星的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度:0.2ppb(ng/ml)

2.2 反应模式:25℃,45min15min

2.3 检测下限:

组织(鸡肉、猪肉、鱼、虾) ………0.6ppb

蜂蜜 ……………………………………0.8ppb

牛奶 ……………………………………6ppb

奶粉 ……………………………………10ppb

鸡蛋 ……………………………………6ppb

尿样 ……………………………………1ppb

血清 ……………………………………6ppb

2.4 交叉反应率:

恩诺沙星………………………………100%

噁喹酸…………………………………28%

左氧氟沙星……………………………10%

洛美沙星………………………………4%

麻保沙星………………………………4%

沙拉沙星………………………………2%

 2.5 样本回收率:

组织、蜂蜜、牛奶、奶粉、鸡蛋、血清……85%±15%

3 试剂盒组成

酶标板……………………………96孔

标准液:各1ml

0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

高标准液(红盖):100ppb …………1ml

酶标记物(红盖)……………………5.5ml

抗体工作液(蓝盖)…………………5.5ml

底物液A(白盖)……………………6ml

底物液B(黑盖)……………………6ml

终止液(黄盖)………………………6ml

20×浓缩洗涤液(白盖)……………40ml

5×复溶液(黄盖)…………………50ml

说明书 ………………………………1份

盖板膜…………………………………1张

自封袋…………………………………1个

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器:酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2 微量移液器:单道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂:无水乙腈、正己烷、浓HCl

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知:

实验器具必须洁净并使用一次性吸头,以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液:

配液1:0.15M盐酸溶液

    5ml浓盐酸,加入去离子水混匀,定容至400ml。

配液2:样本提取液

    量取10ml 0.15M盐酸溶液(配液1)加入到90ml无水乙腈中混合均匀。

配液3:1×复溶液

5×复溶液用去离子水5倍稀释(1份复溶液加4份去离子水),用于样本的复溶,复溶液在4℃环境可保存一个月。

配液4:工作洗涤液

    浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。

5.3 样本前处理步骤:

5.3.1 动物组织(鸡肉、猪肉、鱼、虾)处理方法

1)称2.0±0.05g 均质过的组织样本于50ml离心管中;

2)加入8ml样本提取液(配液2),振荡5分钟,室温4000转/分离心10分钟;

3)取2ml清澈上层有机相至洁净干燥的10ml玻璃试管中,50-60℃水浴氮气吹干;

4)加入1ml正己烷,振荡2分钟,再加1ml复溶液(配液3),振荡30秒,室温4000转/分离心5分钟;

5)去除上层正己烷,取下层水相50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:2    检测下限:0.6ppb

5.3.2 蜂蜜处理方法

1)取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中,加6ml样本提取液(配液2),振荡5分钟,使其充分溶解;

2)加入3ml复溶液(配液3),加入11ml二氯甲烷,振荡5分钟,室温4000转/分,离心5分钟;

3吸去上层,取下层有机相8ml至干燥容器中,50-60℃水浴氮气吹干;

41ml复溶工作液溶解干燥的残留物,再加入正己烷1ml混合30秒,室温3000转/分以上,离心5分钟;

5去除上层取下层50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:2    检测下限:0.8ppb

5.3.3 牛奶处理方法:

1)取25µl样本液与475µl复溶液(配液3)混合,振荡1分钟,使其充分溶解;

2)取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:20    检测下限:6ppb

5.3.4 奶粉处理方法:

1)称取0.5±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中,加入

5ml去离子水,振荡,使其充分溶解;

2)取100µl样本液与400µl复溶液(配液3)混合,振荡1分钟;

3)取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:50    检测下限:10ppb

5.3.5 鸡蛋处理方法:

1)称取1.0±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中,加入5ml去离子水,振荡,使其充分溶解;

2)取100µl样本液与400µl复溶液(配液3)混合,振荡1分钟;

3)取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数:30    检测下限:6ppb

5.3.6 尿样本处理方法

1)用4ml 1×复溶液1ml经离心后的清亮尿样本混合,混合30s;

2)取50µl液体用于分析。  

样本稀释倍数: 5    检测下限:1ppb

5.3.7 血清处理方法

1)取50µl血清样本与1450µl复溶液(配液3)混合,振荡1分钟;

2)取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数: 30    检测下限:3ppb 

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出,置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解,每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。

6.1    号:将样本和标准品对应微孔按序编号,每个样本和标准品做2孔平行,并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应:加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶标记物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗体工作液,用盖板膜封板,轻轻振荡5秒混匀,25℃反应45分钟。

6.3    涤:小心揭开盖板膜,甩去孔内液体,每孔加350ul工作洗涤液,静置30秒后弃去,重复洗涤5次,最后一次拍干(用吸水纸拍干,拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。

6.4    色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,轻轻振荡5秒混匀,25℃避光显色15分钟若蓝色过浅,可适当延长反应时间

6.5     止:每孔加入终止液50µl,轻轻振荡混匀,终止反应。

6.6 测吸光值:用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值(建议用双波长450/630nm)。测定应在终止反应后10分钟内完成。


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