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羧酸酯酶(CarE)活性测定试剂盒说明书

更新时间:2022-05-24 点击次数:742

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义:

哺乳动物CarE,也称脂族酯酶(aliesterase),广泛分布于组织和器官,属于丝氨酸水解酶家

族。CarE 催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解,但不能催化水解乙酰

胆碱及其类似物。CarE 参与脂质运输和代谢,并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解

毒和代谢有关,有机磷农药可结合并且抑制CarE 活性。

测定原理:

CarE 能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固篮显色;在450 nm 光吸收增加速率,计算CarE 活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和

蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:液体×1 瓶,4保存。

试剂二:液体15mL×2 瓶, 4保存;

试剂三:粉剂×2 支, 4保存,临用前取1 支试剂三,加0.6ml 无水乙醇充分溶解;

试剂四:粉剂×2 支,-20保存,临用前取1 支试剂四,加少量试剂二溶解;

工作液配制:临用前配制,向1 瓶试剂二中,加入溶解后的试剂三和试剂四各1 支,充分溶

解,过滤4避光保存,可用1 周。

粗酶液提取:

细菌、细胞样品制备

收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200 万细菌或细胞加入400μL 试剂一,

超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30  );12000g 4离心30min

取上清液待测。

2、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)15~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,

加入1mL 试剂一)进行冰浴匀浆;12000g 4离心30min,取上清液待测。

3、液体:直接测定

测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到450 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37水浴中预热30 min

3. 空白管:取微量玻璃比色皿/96 孔板,依次加入5μL 蒸馏水和200μL 试剂二,迅速混匀,

450nm 处测定3min 内吸光值变化,第10s 吸光值记为A1,第190s 吸光值记为A2A

空白管=A2-A1

4. 测定管:取微量玻璃比色皿/96 孔板,依次加入5μL 上清液和200μL 试剂二,迅速混匀,

450nm 处测定3min 内吸光值变化,第10s 吸光值记为A3,第190s 吸光值记为A4A

测定管=A4-A3

注意:空白管只需测定一次。

CarE 活性计算公式:

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1 组织中CarE 活性


 

1 按蛋白浓度计算

CarE 活性单位定义:每 mg 组织蛋白在 37反应体系中每分钟催化吸光值增加 1 定义为 1

个酶活单位。

CarE 酶活(U/mg prot)= (A 测定管-A 空白管) ×V 反总÷(Cpr×V )÷T

= 13.67×(A 测定管-A 空白管)÷Cpr

2 按样本鲜重计算

CarE 活性单位定义:每g 组织在37反应体系中每分钟催化吸光值增加1 定义为1 个酶活

单位。

CarE 酶活(U/g 鲜重)= (A 测定管-A 空白管) ×V 反总×V 样总÷V 样)÷W÷T

=13.67×(A 测定管- A 空白管)÷W

2 细菌或细胞中CarE 活性

CarE 活性单位定义:每1 万个细菌或细胞在37反应体系中每分钟催化吸光值增加1 定义

为一个CarE 活性单位。

CarE 酶活(U/104 cell)= (A 测定管-A 空白管) ×V 反总×V 样总÷V 样)÷细胞密度(104

cell/mL÷T=13.67×(A 测定管-A 空白管细胞密度(104 cell/mL

3. 液体中CarE 活性

CarE 活性单位定义:每毫升样品在37反应体系中每分钟催化吸光值增加1 定义为1 个酶

活单位。

CarE 酶活(U/mL )= (A 测定管-A 空白管) ×V 反总÷V ÷T

=13.67×(A 测定管-A 空白管)

V 反总:反应体系总体积,205μL=2.05×10-4LV 样总:上清液总体积,1 mLV 样:加入

上清液体积(mL)0.005 mLCpr:蛋白质浓度,mg/mLW:样品质量(g);T:反应时间

min),3min

b. 使用96 孔板测定的计算公式如下


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