微量法 100 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

α-GC(EC 3.2.1.20)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化水解芳基或烃基与糖基之间的α-糖苷键生成葡萄糖，不仅与细胞壁的松弛或加固有关，而且与细胞识别和一些信号分子产生密切相关。

测定原理：

α-GC 分解对-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰， 通过测定吸光值升高速率来计算α-GC 活性。

自备用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 12mL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量

（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。

2、加样表

充分混匀，放入 37℃准确水浴 30min 后，立即放入 95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变），8000g，4℃，离心 5min，取上清液（在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂）

充分混匀，室温静置 2min 后， 400nm 处测定吸光值 A，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。

α-GC 活力计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.00585x -0.0027；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光

值。

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GC 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GC 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=0.114×(ΔA +0.0027)

V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，30min。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为 y =  0.0039x  -0.0027；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光

值。

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GC 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GC 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=0.171×(ΔA +0.0027)

V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，30min。