细胞逆转录酶活性荧光定量检测试剂盒 产品说明书

主要用途

细胞逆转录酶（REVERSE TRANSCRIPTASE）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过双链分子底物，在dTTP的参与下，通过逆转录酶的催化，聚合产生RNA-DNA异源双链DNA分子，由PicoGreen特异染色，即采用荧光法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）逆转录酶的活性，以及抑制剂检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent F）避免光照；有效保证6月 

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

（微型）台式离心机：用于样品操作

200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）

2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用消化）

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B） 

10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

12． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约80下）

13． 将所有细胞匀浆物移入1.5毫升离心管

14． 即刻放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g

15． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

16． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

17． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或纯化酶样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光酶标仪（温度为25℃）：激发波长490nm，散发波长520nm；增益倍数50至100 

3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4． 分别加入10微升裂解液（Reagent B）到1至5号管

5． 移取10微升标准液（Reagent H）到1号管，混匀

6． 小心移取10微升1号管稀释的标准液（Reagent H）到2号管，混匀

7． 小心移取10微升2号管稀释的标准液（Reagent H）到3号管，混匀

8． 小心移取10微升3号管稀释的标准液（Reagent H）到4号管，混匀

9． 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准曲线测定只需1次

4． 样品须澄清，至关重要

5． 每个样品需要进行平行测试：失活样品和待测样品，以排除样品DNA本底

6． 失活样品：将待测样品置于70至90度水浴锅孵育10分钟，然后置于冰槽里冷却

7． 样品中避免使用EDTA、EGTA、NaCl、MgCl2、Triton X-100等

8． 反应完成后即刻进行荧光测定

9． 测定值由低到高变化

10． 样本测定样品读数高于背景读数表明具有酶活性

11． 待测样本为粗提酶样品，其蛋白浓度为10微克/5微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）

12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

13． 逆转录酶单位活性定义为：在25℃，pH 8.1条件下，每小时内能够转录1纳克DNA所需的酶量作为一个活性单位