技术文章
Technical articles主要用途
细菌氢ATP酶(H+-ATPase)活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用氢ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,在排除其它ATP酶干扰的情况下,受到氢ATP酶的水解产生的ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值(NADH浓度)的变化,以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细菌细胞H+-ATP酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。
产品内容
裂解液(Reagent A) 毫升
保存液(Reagent B) 毫升
缓冲液(Reagent C) 毫升
酶促液(Reagent D) 微升
反应液(Reagent E) 毫升
底物液(Reagent F) 毫升
阴性液(Reagent G) 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;底物液(Reagent F),避免光照,有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
1.5毫升离心管:用于样品操作和保存的容器
(微型)台式离心机:用于样品操作
恒温摇床:用于细菌培养
培养箱:用于反应孵育
比色皿:用于光谱分析的容器
分光光度仪:用于光谱分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;底物液(Reagent F)注意避光。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1. 准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时,速度为220RPM
2. 直至OD600=0.4至0.8,即1至2 X 107细胞/毫升
3. 置于冰槽里5分钟
4. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为1000g
5. 小心抽去上清液
6. 加入xx微升裂解液(Reagent A),充分混匀
7. 转移到预冷的1.5毫升离心管
8. 强力涡旋震荡15秒
9. 置于冰槽里30分钟,期间强力涡旋震荡15秒三次
10. 放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为300g(或1000RPM,例如eppendorf 5415)
11. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
12. 放进4℃微型台式离心机离心15分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
13. 小心去掉上清液
14. 加入xx微升保存液(Reagent B),混匀
15. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1)
16. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1. 准备好待测样品(例如纯化细菌细胞膜蛋白等),置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪(温度为37℃):波长为340nm,间隔5分钟,读数7次(共30分钟),并置零
3. 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度
三、背景对照测定
1.移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2.加入xx微升酶促液(Reagent D)
3.加入xx微升反应液(Reagent E)
4.加入xx微升底物液(Reagent F)
5.放进37℃培养箱里静置3分钟
6.加入xx微升阴性液(Reagent G)
7.上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8.即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数30分钟
四、样品活性测定
1.移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2.加入xx微升酶促液(Reagent D)
3.加入xx微升反应液(Reagent E)
4.加入xx微升底物液(Reagent F)
5.放进37℃培养箱里静置3分钟
6.加入50微升待测样品(注意:50微克膜蛋白;样品须溶解)
7.上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8.即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数30分钟
五、计算样品活性
注意事项
1.本产品为21次操作,包括背景对照测定
2.操作时,须戴手套
3.系统操作过程中,背景测定只需1次
4.建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA等,可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等
5.加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
6.反应测定值由高到低变化;测定可以持续30分钟
7.测定值由高到低变化,即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数,表明有酶活性
8.光谱测定后,比色皿须清洗充分
9.建议待测样本膜蛋白浓度为50微克/50微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;注意计算公式的调整(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1)
10.样品特异活性是指排除其它,包括钙(EGTA处理)、钠钾(乌本苷;ouabain处理)等ATP酶的干扰后的氢ATP酶活性
11.氢ATP酶活性单位浓度定义:在37℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位
12.本公司提供系列ATP酶类分析技术产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测准确