网站导航

技术文章

当前位置:主页 > 技术文章 > 细菌氢ATP酶活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒 产品说明书

细菌氢ATP酶活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒 产品说明书

更新时间:2023-04-06 点击次数:667

主要用途

 细菌氢ATP酶(H-ATPase)活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,排除其它ATP酶干扰的情况下,受到ATP酶的水解产生的ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值(NADH浓度的变化,以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适合于各种细菌细胞H-ATP的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。

产品内容

裂解液(Reagent A)           毫升

保存液(Reagent B          毫升

缓冲液(Reagent C         毫升

酶促液(Reagent D             微升

反应液(Reagent E             毫升

底物液(Reagent F           毫升

阴性液(Reagent G            毫升

产品说明书                1

保存方式

保存在-20冰箱里,避免反复冻融;底物液(Reagent F),避免光照,有效保证6

用户自备

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于样品操作和保存的容器

(微型)台式离心机:用于样品操作

恒温摇床:用于细菌培养

培养箱:用于反应孵育

比色皿:用于光谱分析的容器

分光光度仪:用于光谱分析

实验步骤 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;底物液(Reagent F注意避光。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1. 准备好10毫升待测的细菌放进37摇床孵育16小时,速度为220RPM

2. 直至OD6000.40.8,即12 X 107细胞/毫升

3. 置于冰槽里5分钟

4. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为1000g

5. 小心抽去上清液

6. 加入xx微升裂解液(Reagent A,充分混匀

7. 转移到预冷的1.5毫升离心管

8. 强力涡旋震荡15

9. 置于冰槽里30分钟,期间强力涡旋震荡15三次

10. 放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为300g(或1000RPM,例如eppendorf 5415

11. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

12. 放进4℃微型台式离心机离心15分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

13. 小心去掉上清液 

14. 加入xx微升保存液(Reagent B,混匀

15. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1

16. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 

二、测定准备

1. 准备好待测样品(例如纯化细菌细胞膜蛋白等),置于冰槽里 

2. 设定好分光光度仪(温度为37℃):波长为340nm,间隔5分钟,读数7次(共30分钟),并置零

3. 缓冲液(Reagent C室温下均衡温度

三、背景对照测定

1.移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2.加入xx微升酶促液(Reagent D)

3.加入xx微升反应液(Reagent E)

4.加入xx微升底物液(Reagent F)

5.放进37℃培养箱里静置3分钟

6.加入xx微升阴性液(Reagent G)

7.上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

8.即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数30分钟

四、样品活性测定

1.移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2.加入xx微升酶促液(Reagent D)

3.加入xx微升反应液(Reagent E)

4.加入xx微升底物液(Reagent F)

5.放进37℃培养箱里静置3分钟

6.加入50微升待测样品(注意:50微克膜蛋白;样品须溶解)

7.上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

8.即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数30分钟

五、计算样品活性

注意事项

1.本产品为21次操作,包括背景对照测定

2.操作时,须戴手套

3.系统操作过程中,背景测定只需1次

4.建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA等,可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

5.加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定

6.反应测定值由高到低变化;测定可以持续30分钟

7.测定值由高到低变化,即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数,表明有酶活性

8.光谱测定后,比色皿须清洗充分

9.建议待测样本膜蛋白浓度为50微克/50微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;注意计算公式的调整(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1)

10.样品特异活性是指排除其它,包括钙(EGTA处理)、钠钾(乌本苷;ouabain处理)等ATP酶的干扰后的氢ATP酶活性

11.氢ATP酶活性单位浓度定义:在37℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位

12.本公司提供系列ATP酶类分析技术产品 

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测准确


联系方式

邮件:jskangchina@163.com
地址:山东青岛市青大工业园韩海路
微信扫描关注我们
在线客服 联系方式 二维码

服务热线

0532-58720157 0532-58967204

扫一扫,关注我们