细菌氢ATP酶活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒 产品说明书

主要用途

 细菌氢ATP酶（H^＋-ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用氢ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在排除其它ATP酶干扰的情况下，受到氢ATP酶的水解产生的ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细菌细胞H^＋-ATP酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

产品内容

裂解液（Reagent A）           毫升

保存液（Reagent B）          毫升

缓冲液（Reagent C）         毫升

酶促液（Reagent D）             微升

反应液（Reagent E）             毫升

底物液（Reagent F）           毫升

阴性液（Reagent G）            毫升

产品说明书                1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

恒温摇床：用于细菌培养

培养箱：用于反应孵育

比色皿：用于光谱分析的容器

分光光度仪：用于光谱分析

实验步骤 

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM

2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷细胞/毫升

3． 置于冰槽里5分钟

4． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混匀

7． 转移到预冷的1.5毫升离心管

8． 强力涡旋震荡15秒

9． 置于冰槽里30分钟，期间强力涡旋震荡15秒三次

10． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）

11． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

12． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心去掉上清液 

14． 加入xx微升保存液（Reagent B），混匀

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 

二、测定准备

1． 准备好待测样品（例如纯化细菌细胞膜蛋白等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定

1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升酶促液（Reagent D）

3．加入xx微升反应液（Reagent E）

4．加入xx微升底物液（Reagent F）

5．放进37℃培养箱里静置3分钟

6．加入xx微升阴性液（Reagent G）

7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟

四、样品活性测定

1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升酶促液（Reagent D）

3．加入xx微升反应液（Reagent E）

4．加入xx微升底物液（Reagent F）

5．放进37℃培养箱里静置3分钟

6．加入50微升待测样品（注意：50微克膜蛋白；样品须溶解）

7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟

五、计算样品活性

注意事项

1．本产品为21次操作，包括背景对照测定

2．操作时，须戴手套

3．系统操作过程中，背景测定只需1次

4．建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

5．加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定

6．反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟

7．测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数，表明有酶活性

8．光谱测定后，比色皿须清洗充分

9．建议待测样本膜蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）

10．样品特异活性是指排除其它，包括钙（EGTA处理）、钠钾（乌本苷；ouabain处理）等ATP酶的干扰后的氢ATP酶活性

11．氢ATP酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

12．本公司提供系列ATP酶类分析技术产品 

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确