过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(钼酸铵微板法)说明书

产品简介：

过氧化氢酶(Catalase，CAT)又称触酶，是一类以铁卟啉为辅基的结合酶，由四个相同亚单位组成的四聚体酶，共含4分子的亚铁血红素作为辅基，分子量约为24KD，CAT能将细胞代谢产生的毒性物质过氧化氢迅速清除，可与 GSH-Px 共同保护巯基酶、膜蛋白、过氧化氢解离。

自备材料：
1、蒸馏水、生理盐水
2、研钵或匀浆器、离心管、离心机、水浴锅或恒温箱、酶标仪、96 孔板
操作步骤(仅供参考)： 
1、配制65mM H2O2基液：本试剂盒提供的 H2O2 基液中的H2O2浓度约为1M，由于过氧化氢不是非常稳定，使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度，把浓度约为1M的H2O2基液用本CAT Assay Buffer稀释100倍，使H2O2基液中的 H2O2 浓度约为10mM；分光光度计测定A240(一般情况下新配制的10mM H2O2 基液A240在0.4~0.45左右，经过3个月以后A240 在0.35~0.4 左右)，H2O2浓度(mM)=22.94×A240，进而计算出本试剂盒提供的H2O2基液中的H2O2的实际浓度，然后再根据实际的过氧化氢浓度， 配制65mMH2O2基液。
2、配置MO显色液：称取0.4g钼酸铵试剂加入到 10ml 蒸馏水中，充分溶解即成，MO显色液易出现乳白色样物质，应弃用，尽量现用现配，该试剂盒提供的钼酸铵试剂为过量。 

3、准备样品：
①细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行裂解，可以采用 RIPA裂解液，如有必要可进行适当匀浆，低速离心取上清，-20℃冻存，用于CAT的检测。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备，用生理盐水10倍稀释后，可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接测定，不能及时检测可-20℃冻存。
③全血样品：收集适量的全血至一抗凝管内，颠倒混匀，取全血冻融一次，用CAT Assay Buffer 1000倍后进行CAT检测。
④血液中的红细胞裂解液：用抗凝管收集血液，颠倒混匀，取至少 500μl 全血 4℃ 3000g 离心 5min，弃上清，沉淀用预冷的生理盐水洗涤3次，用约5倍细胞体积的预冷的去离子水，例如 Milli-Q 纯水，重悬细胞沉淀，冰浴 10min；使用前用 CAT Assay Buffer 稀释400倍后进行CAT检测。
⑤植物样品：准确称取植物材料(果肉或者去叶脉的叶片)0.5g，剪碎，置于4℃预冷的研钵或匀浆器中，加入预冷提取液 1ml，低温研磨至匀浆后转移至离心管，用3ml 提取液冲洗研钵或匀浆器并转入离心管，加提取液至总体积为 5ml；4℃ 10000r/min 离心20min，上清液为酶提取液，上清液可用于CAT的检测。提取液配方：无水磷酸氢二钠
3.3g+二水磷酸二氢钠 0.13g，补水至 200ml，溶解即为提取液，4℃保存备用。注意：如果 CAT 酶活性较低，应相应减少提取液的总体积，以便提高CAT 酶的浓度。
⑥高活性样品：如果样品中含有较高活性的CAT，可以使用CAT Assay Buffer 稀释。
⑦(选做)样品准备完毕后可以用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的CAT含量。 

注意事项：

1、 该试剂盒亦可用分光光度计进行测定，但检测的样本数相应减少。
2、 待测样品中不应含有CAT抑制剂，同时需避免反复冻融。
3、 CAT Assay Buffer 如果出现浑浊或絮状物，应弃用。
4、 MO显色液配置后可4℃稳定两周，如果出现乳白色物质应弃用，最好现用现配。
5、 对于植物样品研磨处理应迅速，以免CAT酶活下降，同时尽量置于冰浴状态处理；另外本法不推荐用于植物样本CAT的检测，最好采用过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外比色法)。
6、 完整的红细胞以及未稀释的溶血液中的过氧化氢酶置于4℃ 1周仍然较稳定，稀释后的溶血液中CAT容易失活。
7、 尽量避免冰冻样品造成溶血，否则过氧化氢酶活性会下降10~15%。
8、 血清样品室温下3天内活性下降 64.7%，4℃条件下下降 10.5%，-20℃保存30天活性仅下降3.5%，因此待测样品均应-20℃或-70℃保存。

9、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

10、试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

有效期：12 个月有效；低温运输，按要求保存。