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Technical articles
更新时间：2025-06-13
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主要用途
细胞基质金属蛋白酶2（MMP2）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针MCA供体和DAP/DNP受体双重标记的多肽底物PLGLAR，在特定抑制剂存在与否的情况下，受到MMP2蛋白酶的水解，解离抑制基团，产生荧光产物，即采用荧光法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或纯化酶样品中基质金属蛋白酶2的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。
保存方式
保存底物液（Reagent D）、标准液（Reagent E）和专性液（Reagent F）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证3月
用户自备
1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞
（微型）台式离心机：用于样品操作
培养箱：用于反应孵育
黑色酶标板：用于荧光分析的容器
荧光酶标仪：用于荧光分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备
1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2. 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5. 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7. 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10. 转移到预冷的1.5毫升离心管
11. 强力涡旋震荡15秒
12. 置于冰槽里孵育30分钟
13. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15. 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
16. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、荧光测定
（一）样品总活性测定
1． 在96孔酶标板上做好相应标记：标准样品、样品总活性
2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到相应孔中
3． 分别加入20微升上述配制的标准液或待测样品（20微克纯化酶或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）
4． 放进37℃培养箱里孵育10分钟
5． 分别加入xx微升底物液（Reagent D）
6． 轻轻摇动96孔酶标板
7． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）
8． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位RFU；横座标（X轴）为标准甲氧基多肽浓度（微摩尔/升）
9． 根据标准曲线获得样品总活性对应甲氧基多肽浓度（微摩尔/升）
（二）样品非特异活性测定
1． 在96孔酶标板上做好相应标记：样品非特异活性
2． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到相应孔中
3． 加入xx微升专性液（Reagent F）到相应孔中
4． 加入20微升待测样品（20微克纯化酶或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）
5． 放进37℃培养箱里孵育10分钟
6． 分别加入xx微升底物液（Reagent D）
7． 轻轻摇动96孔酶标板
8． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）
9． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位RFU；横座标（X轴）为标准甲氧基多肽浓度（微摩尔/升）
10． 根据标准曲线获得样品非特异活性对应甲氧基多肽浓度（微摩尔/升）
三、计算样品活性
（一） 样品活性（总活性或非特异活性）
（二） 样品特异
注意事项
1． 本产品为25次操作，包括标准液
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，标准液测定只需1次
4． 样品须澄清，至关重要
5． 样品准备要点如下：
a) 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂
b) 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）
c) 如果样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂（建议使用胶原酶潜酶活化剂（APMA）－GMS12197）
6． 如果用户没有特定的滤波器，可以使用激发波长320至340nm之间的任一波长，散发波长390至420nm之间的任一波长
7． 待测样本为酶粗提样品，其蛋白浓度为20微克/50微升；待测样本为总蛋白，其蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
8． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
9． 如果检测部分或纯化酶样品中基质金属蛋白酶2，则可以省去非特异活性检测步骤
10． 基质金属蛋白酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5的情况下，每单位OA-Hy敏感性酶在单位时间内（每分钟）水解1纳摩尔的多肽底物PLGLAR
11． 本公司提供系列基质金属蛋白酶检测试剂产品
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