乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）活性检测试剂盒说明书

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

规格:50T/24S

产品简介：

可见分光光度

乙酰辅酶 A 羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）在生物体内催化乙酰辅酶 A 羧化生成丙二酰辅酶 A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC 的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC 能够催化乙酰辅酶 A、NaHCO₃ 和 ATP 生成丙二酰辅酶 A、ADP 和无机磷，钼蓝与磷酸根生成 660nm 有特征吸收峰的物质，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 ACC 活性。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计、天平、低温离心机、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、水浴锅、蒸馏水、冰盒、EP 管。

产品内容：

提取液一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

提取液二：液体 0.6mL×1 支，-20℃避光保存； 试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 12.5mL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 6mL 双蒸水，充分溶解待用；可分装后-20℃保存， 避免反复冻融；

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 15mL 双蒸水，溶解后 4℃保存一周； 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 15mL 双蒸水，溶解后 4℃保存一周； 试剂六：液体 15mL×1 瓶，室温保存；

标准品：10μmol/mL 标准磷贮备液 1mL×1 支，4℃保存；

提取液的配制：按提取液一：提取液二=990：10（V：V）的比例配制，根据样本量现配现用， 禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。

工作液（定磷剂）的配制：按 H₂O：试剂四：试剂五：试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的工作液应为浅黄色。若变色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，工作液应现配现用。

注意：配试剂用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL

提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

血清（浆）：直接测定。二、测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。

2、 将 10μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为 1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL 的标准溶液备用。

3、 操作表：(在 1.5ml 离心管中依次加入下列试剂) 酶促反应：

三、ACC 活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将ΔA 带入方程得到 x（μmol/mL）

2、 ACC 活性的计算：

1. 按蛋白浓度计算

酶活定义：每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位

ACC 酶活（U /mg prot）=x×V 总÷（V 样×Cpr）÷T=20x÷Cpr。

2. 按样本质量计算

酶活定义：每小时每 g 组织产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

ACC 酶活（U /g 鲜重）=x×V 总÷（V 样×W÷V 样总）÷T=20x÷W。

1. 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每小时每 10⁴ 个细菌或细胞产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

ACC 酶活（U /10⁴ cell）=x×V 总÷（V 样×细胞数量（万个）÷V 样总）÷T

=20x÷细胞数量（万个）。

2. 按液体体积计算

酶活定义：每小时每 mL 液体产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

ACC 酶活（U /mL）=x×V 总÷V 样÷T=20x。

V 总：酶促反应总体积，0.5mL；V 样：加入样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；

T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本鲜重，g。

注意事项

1、 工作液（定磷剂）应现配现用，正常颜色为浅黄色，如有变色或变蓝则均为失效。

2、 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管或 EP 管等试验器材均要求严格无磷。

3、 显色结束后应立即检测。

4、 当ΔA 大于 1 时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。