注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

方法：微量法

 货号：H0101

规格:   100T/48S

 产品内容：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存，用前混匀即可；

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

 产品说明：

PPO（EC1.10.3.1）是一种广泛存在于植物体内的含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

PPO 能够催化邻苯二酚产生邻苯二醌，后者在 410nm 有特征光吸收。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。

2、称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 410nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）

PPO 活性计算：

1. 用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每分钟每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

PPO（U/mg prot）= ΔA÷0.01×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T =60×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每分钟每 g 组织在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

PPO（U/g 鲜重）=ΔA÷0.01×V 反总÷（W÷V 样总×V 样）÷T =60×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每分钟每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

PPO（U/104 cell）=ΔA÷0.01×V 反总÷（500÷V 样总×V 样）÷T =0.12×ΔA

2. 用96 孔板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每分钟每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.005 定义为一个酶活力单位。

PPO（U/mg prot）=ΔA÷0.005×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T =120×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每分钟每 g 组织在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.005 定义为一个酶活力单位。

PPO（U/g 鲜重）=ΔA÷0.005×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T =120×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每分钟每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中使 410nm 处吸光值变化 0.005 定义为一个酶活力单位。

PPO（U/104 cell）=ΔA÷0.005×V 反总÷（500÷V 样总×V 样）÷T =0.24×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞数量，500 万； T：反应时间，10min。