动物组织氧化应激活性氧鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒说明书

主要用途

动物组织氧化应激活性氧（ROS）鲁米诺化学发光法定量检测试剂是一种旨在通过自由基探针鲁米诺和强化剂的参与下，组织样品中的活性氧族使发光物氧化降解并发光，在化学发光仪（Luminometer）的帮助下定量检测样品中活性氧族的生成和数量的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种动物和人体组织的活性氧族的检测。可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学，以及发育生物学（男性不育）等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定，检测敏感。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。鲁米诺（luminol），又称氨基邻苯二甲酰肼（luminol； 3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一种脂溶性的发光剂，氧化后生成鲁米诺自由基而化学发光，具有460nm左右峰值的带状光谱，肉眼可观察到鲜明的紫蓝色。鲁米诺以单价氧化形式与超氧自由基阴离子反应，产生不稳定性内过氧化物或二氧环丁烷（Dioxetane），由此分解成电激发状态，通过释放光子，回复到基态。鲁米诺作为探针，可以检测组织细胞中超氧自由基阴离子和羟自由基，其发光强度与水平成正相关。 

产品内容

清理液（Reagent A）            毫升

强化液（Reagent B）            毫升

发光液（Reagent C）            毫升

产品说明书               1份

保存方式

保存强化液（Reagent B）和发光液（Reagent C）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

微型台式离心机：用于去除样品杂质

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织样品

超声仪：用于裂解组织样品

测试管或黑色96孔板：用于发光检测用的容器

化学发光仪：用于检测化学发光

实验步骤

一、 样品预处理

1． 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管（200毫克组织）

3． （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）

4． （选择步骤）小心抽去清理液（Reagent A）

5． 放进一个15毫升锥形离心管

6． 加入置于冰槽里的xx毫升清理液（Reagent A） 

7． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

8． 在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）

9． 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管

10． 强力涡旋震荡5秒，充分混匀

11． （选择步骤）在冰槽里，置于200瓦超声仪下，功率50％，猝击5秒

12． 转移到预冷的1.5毫升离心管

13． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取1毫升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． （选择步骤）移取5微升进行蛋白定量测定，并调整蛋白浓度为20毫克/毫升（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

16． 置于冰槽里继续后续操作（1小时内）

二、 测读

测读开始前，打开化学发光仪，设定仪器内温度为37℃预热和整合测读1秒；然后关掉实验室的灯光。将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化，严格置于暗室里。然后进行下列操作。

1． 准备好测试管，做好标记：阴性对照、样品本底和样品活性

2． 移取xx微升清理液（Reagent A）到阴性对照测试管

3． 移取400微升上述预处理的待测样品到样品本底测试管

4． 移取400微升上述预处理的待测样品到样品活性测试管

5． 分别加入xx微升强化液（Reagent B）到上述测试管，除样品本底测试管外

6． 分别加入xx微升发光液（Reagent C）到上述测试管，除样品本底测试管外

7． 轻轻涡旋混匀

8． 即刻放进37℃化学发光仪里测读（注意：建议瞬时测读或30秒内测读）

9． 整合测读1秒，获得相对发光单位（relative light unit；RLU）

10． 或者测读光电子读数：X 10⁶ CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液体闪烁仪替代）

11． 计算ROS水平：

注意事项

1． 本产品为50次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 测试前，动物组织须新鲜收集，1小时内为

4． 组织裂解悬液制备后即刻测读，不宜过夜保存

5． 组织裂解悬液须清澈

6． 如果测定体系变化，则试剂用量相应变化

7． 系统操作过程中，阴性对照只需测定一次

8． 测读的所有步骤均须在暗室里进行

9． 根据活性氧值浓度高低，用户可以调整样品量

10． 必要时，例如活性氧族过低，可以浓缩样品处理

11． 如果是注射式化学发光仪，建议测试前后使用无离子水冲洗化学发光仪注射（injector）管道

12． 本公司提供系列活性氧分析试剂产品