实验室化学分析标准曲线的绘制

实验室化学分析标准曲线的绘制

用生物药物分析法（光谱法、色谱法与面议分析法）测定生物样品中的药物浓度时，都必须同时作标准曲线。尽管各种分析方法涉及的原理和方法技术有所不同，但标准曲线制备方法却又共同的相似之处，如一般均采用空白生物基质中加入定量的药物标准品混匀，配制成药浓已知的标准生物样品，然后与样品同时测定，zui后用标准药浓对响应值建立标准曲线。此外，生物药物分析还常常面临测定体液和器官（或组织）两类性质不同的样品，因此下面分别针对性的进行介绍

一  体液样品（标准曲线制备）

体液样品以血浆、血清为zui常用，下面以血清样品为代表（并以苯妥英血清药浓为例），说明体液样品测定时标准曲线的制备方法。

苯妥英的有效血药浓度为10-20mg/L(即10-20ug/ml），标准曲线浓度应涵盖此范围，测定时采用内标法（卡马西平为内标）

1. 标准溶液的配制

苯妥英标准溶液（贮备液）的配制，精密称取苯妥英标准品20mg，用0.1mol/l NaOH液溶解后定量转移100ml容量瓶中，然后用蒸馏水溶解后同法定容成100ml。然后将配置的贮备液（含苯妥英0.2g/l，即20ug/100ul）置冰箱内4℃保存。

1. 内标（卡马西平）溶液的配制 精密称取卡马西平标准品20mg，用甲醇溶解后定量转移100ml容量瓶中，并加甲醇至刻度，置冰箱内4℃保存（含内标0.2g/l,即20ug/100ul）

说明：

对药物纯度的要求:目前很多药物尚无标准品供应，由于生物药物分析允许的误差稍宽，因此一般可使用符合药典标准的原料药物作为标准品。药典规定原料药物含量一般在98%以上，只要按药典规定方法干燥后，即可供配制标准溶液。对于其他含量规定较低的药物或从制剂中提取出来的药物，则需要经测定含量后，按实际含量配制成标准溶液

对内标纯度的要求：与被测药物一样，通常内标也无标准品供应。用内标法定量时要求同一批样品中（标准曲线各管与样品各管）加入想等量的内标，而无需确知加入内标的准确量（因内标量不参与计算），不可求内标具有高纯度与高含量，但要求齐化学组成恒定，试用期内稳定，并且不含干扰自身和被测组分（药物与待测物）等色谱峰的杂质，这是对内标纯度的基本要求。在实际工作中，常常遇到某药物为合适的内标，却无原料药物可供使用的情况，此时可从该药物的只制剂中提取，并适当精处理，只要无干扰分析的杂质村子，组成稳定，即可供作内保使用

标准溶液的稀释

标准曲线拟用5个浓度点，稀释时取洁净、干燥的试管5支，分别编号为a b c d e 然后按下图方法稀释，使每管稀释液中含苯妥英浓度分别为5.0、40.、2.5、2.0、1.0（ug/100ul）

说明：

为方便快速稀释，应使用带可更换塑料尖头的定量移液管（微量取样器）

倍数稀释的原理：银两种水溶液混合时不会发生所容显现，因此当标准溶液的体积苦熬大若干倍时，则药浓降低相同倍数。所以可将浓贮备液或以稀释后的贮备液按一定倍数比稀释，得到所要求的药物浓度，如于a管中先加入100ul贮备液（20ug/100ul）,软后再加入300ul蒸馏水混匀，则叨叨5ug/100ul的稀释液，又如于C管中加入200ul以稀释好的a管内溶液（5ug/100ul)，然后加入200ul蒸馏水混匀，记得到2.5ug/100ul的稀释液。稀释时为确保准确的倍数比关系注意一下几点

a、应使用干燥试管。

b、医用同一支定量移液管吸取带混合的两种液体（药物标准溶液和蒸馏水）,如此可避免移液管体积不准引入的误差。例如，试管a内的稀释：可用同一支100ul的移液管，先加入100ul贮备液（20ug/100ul），加入蒸馏水3次（100ul*3），混匀后得到5.0ug/100ul的溶液:蒸馏水的加入改用另一只大号移液管一次加入300u.l，则可能由于移液管本身体积的准确性使两次加液体积比偏离（1:3）而引入倍数比误差。

c、溶解药物标准的溶剂硬件量用蒸馏水（或稀酸，碱溶液），引用蒸馏水稀释时不会发生缩容现象，只有不溶于水的药物，才能考虑使用甲醇或乙醇溶解。

   配置药物标准血清浓度时没分空白血清中拟加入100ul药物标准溶液稀释液，  因此上表第二栏 欲稀释的药物浓度以ug/100ul计。当然表中没分空白血清中加入的药物稀释液体积也可改为（50ul)时体积的准确度稍差，二加入大体积优惠增大许晴样品预处理的体积 ，因此习惯上以加入100ul较为适宜。

   上表是先弄配药物标准品贮备液（冰箱保存）临用时取少部分放至是问候在采用倍数稀释法  使成所需浓度，其优点是贮备液长期保持冷贮并且开平次数少，可保持药物及 其浓度的稳定，有趣事甲醇或乙醇配置时，多次开屏使其浓度发生改变，当然若经试验证明吴颖贤，一颗照此法配成目标浓度后使用。

因没分样品中拟加入内标（卡马西平）溶液100ul，配制浓度也用 ug/100ul标示。上面的介绍的方法是直接将卡马西平赔偿目标浓度，实际工作中可浓配后贮存，临用时再行稀释。

上表中zui后一栏各管内溶液体积，系全部稀释完毕后个管内溶液的试剂体积。配置血清药物标准浓度时见下表，自上表没观众吸取100ul，为保证有足量供吸取，因此个管内的溶液应多于100ul。

药物血清标准浓度的配制

制备标准曲线时，需用抑制药浓的血清标准样品，通常是现将苯妥英标准溶液稀释成抑制浓度，然后取一定体积加入到空白血清中混匀，得到药物血清标准浓度，配制时可照上表对应的苯妥英稀释液100ul，即A管中加入a液（5.0ug/100ul）、B管中加入b液（4.0ug/100ul）、C管中加入c液（2.5ug/100ul）·····一次类推，S代表供测样品管，内城血清样品0.2ml，补加蒸馏水100ul，使与标准曲线各罐体及一致（均为0.3ml）。虽然此时体积均一致，但各管血清量实为0.2ml，因此认为管内的药物量系0.2ml血清所含，换算成每ml计的血清药物浓度分别为下表所示，

说明：

因为测定时拟用0.2ml血清样品，因此标准曲线内加入空白血清量为1.2ml。测定时许晴样品的去用量，应根据样品实际含药浓高低和测定方法灵敏度而定，含药浓高者，许晴样品用量可减少，具体取样量应通过试验确定，但无乱取样量多少，标准曲线各管中加入的空白恤清凉英语样品测定一致

上表中勒出1份样品（S管）,实际测定时样品数量较多。为使操作方便，可将样品与标准曲线镉浓度的编号，预先写在小块胶布条上，再将胶布条贴在是观赏，当样品管依照下表末栏补加蒸馏水之后，一下各管的预处理操作*相同，而预处理个步骤中常设计溶液的转移，须更换试管，当试管内溶液转入另一试管后，可将其上的胶布去下，随即转贴于新欢的是观赏，如此有条不紊的惊醒预处理，可加快操作速度，保证与处理完毕后各管内容物对应于元血清样品或标准曲线各管。

标准曲线制备与样品分析

上表配置好苯妥英个许晴标准浓度，并将个许晴样品补加100ul蒸馏水后于个观众分别加入内标溶液100ul（含20ul卡马西平）,混匀后加入0.2ml磷酸盐缓冲液（0.1mol/L,ph7.5)及乙酸乙酯1.5ml，置旋涡混合发生器上萃取10分钟后离心（200-2500r/min）。吸取上清液1.2ml入尖底试管，并将试管置于水浴中（35-40℃）通过压缩空气挥干，残渣用30ul流动相重组，进样20ul左色谱检测，用色谱数据处理机记录苯妥英和内标的峰高，并计算出各分样品（血清样品及标准曲线各浓度）的峰高比（苯妥英/内标），现以某次测定数据为例，测得的数据及处理见表14-4，以峰高比对苯妥英血清标准浓度作图，得到的标准曲线见下表。

说明：

血清样品中苯妥英浓度球阀：由14-3中待测血清样品（S管）的峰高比（0./861），可直接冲标准曲线上查的血清样品中苯妥英的浓度，也可将峰高比带入回归方程式计算后求得。

器官、组织样品

器官、组织系半固体装样品，因此标准曲线制备与杨平测定方法有别于体液样品，下面一动物肝脏内药物分布量测定为例，贾少标准曲线制备方法、样品测定以及药物分布量计算方法。

1、用同种空白基质加药物标准品制备标准曲线

测定动物肝脏内药物分布量时，可另取健康动物肝脏，按照制备样品肝匀浆相同方法作成空白肝匀浆。标准曲线制备时，扔参照前面提到的方法，知识用空白肝匀浆代替表中第3栏的空白许晴，尹云江的粘稠度与匀浆制备时外加的溶液里量多少有关，若加入量较少，则匀浆较粘稠，则取量可改用体积计，若加入量较少，则匀浆粘稠，则取量可改用重量，此时标准曲线横坐标改为单位重量重要浓度。参照以上图标A-E标准曲线各管中加入的空白肝匀浆量，亦是根据样品分析时需要的肝匀浆量二区订单的，（应与其等量），当于标准曲线个观众加入空白肝匀浆与样品管中加入被测肝匀浆后，再按表14-2中第五栏和第六栏方法，于标准曲线个观众加入药物标准溶液稀释液100ul，于样品管中加入等量的内标溶液混匀，取经过预处理后的溶液进行分析，一标准曲线各管得到的药物色谱峰响应值，或药物与内标色谱峰响应值之比（内标法）对标准曲线各浓度作图，得到标准曲线，样品肝匀浆中的药物浓度，可由金阳后获得的药物峰响应值，从标准曲线上求得。

从上面标准曲线上得到的样品匀浆中药物的浓度（ug/ml或ug/g），做匀浆前可先称定肝脏重量，做匀浆时记录加入生理盐水或其他溶液后的体积或重量，然后在制成匀浆，由此可知匀浆体积或重量与肝组织种之间的换算关系。当测定出匀浆中的药物浓度后，便可换算成单位重量肝组织中韩药量，进而得到整治肝脏内的韩药量。用药物标准溶液直接进样简历标准曲线（共样品*提取定容后测定用）

与药物浓度测定相比，测定器官、组织中药物的分布量时，需分析的样品数量相对较少，并且不要求快速提供结果，因此可将药物自生物材料中全部提取尽后定容，然后进行分析，直接冲标准曲线上得到对应的药物浓度。

标准曲线的制备  可将药物标准品溶液准确稀释成4-5中浓度，然后自各浓度稀释液取相同体积进样，记录药物色谱峰响应值（峰高或峰面积），以药物色谱峰响应值对药物敬仰量（20ul内所含药物量）作图，级的标准曲线。此外也可曲线同一种浓度的标准溶液进行4-5次，每次进样不同体积，同上以药物色谱峰响应值对药物进样量（进样体积内所含药物量）左标准曲线，上述标准曲线的药物量范围，英语赝品分析先适应，即覆盖样品处理后进样溶液内的药物量。

药物的*提取预定量 现将气管，组织样品照前述方法做成匀浆，然后准确取一定量置于试管中，加入缓冲液后用适当的有机溶剂漩涡混合萃取，林夕后分出有机溶剂层，如此反复萃取4-5次，直至将药物萃取尽。将各次离心后分出的有几层合并，定容后供进样分析，若进样分析后发现有干扰杂质，可将有机层用另一种缓冲液再行多次反萃，使药物定量转入水层，水层合并后定容，供进样分析，由进样后得到的药物色谱峰响应值，从标准曲线上查的对应的腰五粮，再根据进样体积与提取液定容体积。换算成提取液中的药物量，此即为取量匀浆中含有的腰五粮，然后再换算成原器官，组织含药物量、

为确定匀浆中的药物萃取*需要的条件，可将定量的药物标准品溶液加入空白匀浆中混匀然后再行萃取，以药物能全部定量回收作为判断指标，由此确定萃取时合适的溶剂种类、萃取次数、溶液PH,以及样品是否需要蛋白处理等必要条件。