大鼠腺垂体细胞原代培养

大鼠腺垂体细胞原代培养

原理：

采用酶消化法分次消化腺垂体，进行原代培养。

材料：SD大鼠、胰蛋白酶、胶原酶、DNA酶I、DMEM等。

方法：

1SD大鼠经过1%戊芭比妥钠腹腔麻醉，打开胸腔，剪破心脏放血，用75%究竟浸泡后移入细胞培养室，开颅取腺垂体。

2、将腺垂体用D-Hank`s液一次冲洗三次，移入青霉素瓶内剪破至糊状，分别加入0.375%胰蛋白酶、600u/ml胶原酶和200u/mlDNA酶I（1:1:1），37℃振荡消化30分钟，吸管吹打，吸出细胞悬液移入含有新生小牛血清的DMEM培养液内中止消化，4℃保存。余下的为消化的组织块补加消化酶，37℃二次消化20分钟。

3、终止消化后，1000rpm离心5分钟，弃上清液，加DMEM培养液5ml，轻吹起细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清液，加入含100ml/L小牛血清的DMEM液，吹打均匀。

4、用血细胞计数板镜检细胞计数，调整细胞密度，以5x10/L的密度接种于直径6cm的培养基和96孔板内，移入CO孵箱中，在37℃，在37℃，50ml/L CO2及饱和湿度条件下培养，24小时后换液，之后每隔48小时换液一次。

注意事项：

1、为避免残留的血液影响消化效果，要充分放血。

2、取腺垂体时要小心，力度适中，避免把垂体夹碎。