间接ELISA法筛选阳性杂交瘤及测定单抗清河常数

间接ELISA法筛选阳性杂交瘤及测定单抗清河常数

   酶联免疫吸附测定法，简称ELISA（enzyme-linkde innunosorbent assay），是把特异性的抗原抗体结合反应与酶促反应相结合，zui后以酶促反应的放大作用来显示zui初的免疫反应，它既能用于抗原的测定又可用于抗体的测定。间接ELISA法及时能测定抗体的一种ELISA方法，现将可溶性抗原或细菌细胞包被于聚苯乙烯酶标板上，然后加入待测抗体液，在加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠抗体，zui后加入HRP底物，依据显色反应的程度来判断抗体的有无及活性的高低。间接ELISA具有敏感性高，可检测抗体浓度在ug-ng/ml水平，重复性好，快速简便等优点，是筛选阳性杂交瘤及测定单抗亲和常数的常用方法。

材料与方法

间接ELISA筛选阳性杂交瘤

1、抗原包被 如是可溶性抗原、根据其面议原性用碳酸盐缓冲液（0.01mol/L Na2CO30.01mol/L NaHCO3， PH9.6)溶解成0.1-20ug/ml，然后以每孔0.1ml加入96孔聚苯乙烯酶标板中，4℃guo夜。

如是细胞抗原，则将对生长期每孔含10个细胞加入酶标板，37℃ 5% CO2孵箱培养24-48小时，令细胞场面贴壁后，弃培养液，已含0.05%Tween-20的PBST液洗1次，加入0.05%戊二醇0.1ml，4℃置5分钟，然后以PBST洗3次，每次3分钟。

2 封闭 PBST洗包被板1次，每孔加0.1ml0.1%牛许晴血蛋白液（溶于PBS），4℃guo夜已封闭非特异性位点。

3 一抗温育 将封闭好的酶标板以PBST洗1次，无菌下取融合细菌孔发黄的待测培养液加入酶标板，每孔0.1ml，一个待测样品设两个检测孔。用无菌细胞生长孔培养液做阴性对照，如有阳性抗体对照也应设置阳性对照。37℃温育1小时。

4 酶标二抗温育 弃去待测上清，PBST洗3次，每次3分钟。加入用PBS液稀释成使用浓度的HRP标记的羊抗小鼠Ig抗体，37℃温育1小时。

5 洗涤 弃去酶标二抗，PBST洗6次，每次3分钟。大鼠ELISA试剂盒

6 显色反应 避光下，先用现配邻苯二胺（OPD）底物反应液，40mgOPD荣誉100mlPH5.0柠檬酸缓冲液中（含柠檬酸·H2O 2.10g,Na2HPO4·12H2O 7.61g），并加入30%H2O2150ul，然后每孔0.1ml加入酶标板，观察显色反应状况，一般10分钟左右即可每孔加入2mol/LH2SO4 0.1ml 以终止显色反应。

7 结果判定 在酶标测定仪上一扫描波长492nm测量各孔吸光值，以待测孔吸光值高于阴性对照空0.5（可溶性抗原）或0.2（细胞抗原）为阳性结果。

间接ELISA法测定单抗亲和常数

1 实验操作流程基本上上诉实验相似。

2 根据预实验经验，选择3个城北比稀释的抗原浓度包被96孔酶标板，如可溶线抗原可选择1ug/孔，0.5ug/孔，0.25ug/孔包被，细胞抗原可选择2x，1x，0.5x。

3 大策纯化抗体的起始浓度为1mg/ml左右，以1:50,1:100，1:400,1:800,1:1600,1：:3200,1:6400,1:12800稀释度加入酶标板，且每个稀释度至少应设置2个测定空。

4 根据酶标仪测定结果，扣除阴性对照值，然后以吸光值纵坐标，以抗体稀释度的对数为横坐标作剂量反应曲线，计算每个抗原包被浓度下zui大吸光值一半时对所对应的抗体浓度。即抗体的相对亲和力

5 根据公式计算前和常熟Ka Ka=(n-1）/2（nAb-Ab)。其中Ab,Ab分别为包被抗原浓度为Ag,Ag时，zui大吸光值一半时所对应的抗体浓度。N=Ag/Ag,n一般取2即可，zui后常数表示Ka=X±1.96SE.

注意事项

1间接ELISA筛选阳性孔融合细胞，阳性结果应至少重复两次才比较可靠，否则容易出现假阳性结果。

2 测定亲和常数时，抗原的包被浓度要选择适当，每步要充分封闭，充分温育，充分洗涤，以防记过出现偏差。

3 间接ELISA法一定要设置阴性对照，如有阳性对照，也应设置，以供参考。