紫外吸收法测定核酸的含量

紫外吸收法测定核酸的含量

目的要求

        学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。

实验原理

    核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用（p）来表示。（p）为每升溶液中含有1g原子核酸麟的光吸收值（即A值）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。

    蛋白质也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上。DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先出去。

试剂和器材

1、试剂

    钼酸铵-过氯酸沉淀剂：取3.6mL，70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液。

   5%～6%氨水：用25%～30%氨水稀释5倍。

2、测试样品

    RNA或DNA干粉

3、器材

    移液管0.5mL（×2），2mL（×3）；容量瓶50mL（×3）；离心机；水浴；分光光度计。

操作方法

（1）、准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/L  NaOH调成糊状，再加适量水，用5%～6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。

（2）、取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在水浴上放置30min。

（3）、在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。