乳酸脱氢酶活力测定

乳酸脱氢酶活力测定

目的要求

1、了解乳酸脱氢酶活性测定原理

2、学习用别色法测定酶活性的方法

实验原理

    乳酸脱氢酶广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键之一。

    LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度更为简单、快速。鉴于NADH、NAD+在340nm及260nm处有各自的zui大吸收峰，因此以NAD+为捕酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油-3-3磷酸脱氢酶等。

    本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察NADH在反应过程中340nm处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下每分钟A340下降值为1.0的酶量为1个单位。

试剂和器材

1、试剂

50mmol/L，pH6.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液母液：

溶液A，50mmol/L，k2HPO4：称K2HPO4，1.74g加蒸馏水溶解后定容至200mL。

溶液B，50mmol/L，KH2PO4：称KH2PO4，3.40g加入蒸馏水溶解后定溶至500mL。

取溶液A31.5mL+溶液B68.5mL，调节pH至6.5.置4℃冰箱备用。

10mmol/L  pH6.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。

0.2mol/L  pH7.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液母液：

溶液A，0.2mol/L，Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O，71.64g加蒸馏水溶解后定容至1000mL。

溶液B，0.2mol/L， NaH2PO4：NaH2PO4·2H2O，31.21g加蒸馏水溶解后定容至1000mL。

取溶液A84mL+溶液B16mL，调节pH至7.5.置4℃冰箱备用。

0.1mol/L，pH7.5磷酸盐缓冲液，用上述母液稀释得到。现用现配。

NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L,pH7.5磷酸缓冲液1mL，摇匀。现用现配。

丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L，pH7.5磷酸缓冲液29mL，使其*溶解。现用现配。

2、材料

兔肉。

3、器材

组织捣碎机；移液管5mL（×2），0.1mL（×2）；微量注射器10uL（×1）；恒温水浴。分光光度计。

操作方法

1、制备肌肉匀浆

    称取20g兔肉，按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10nmol/L，pH6.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续3次。将匀浆液倒入烧杯中，置4℃冰箱中提取过液，过滤后得到组织提取液。

2、LDH活力了测定

    预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1mol/L，pH7.5磷酸盐缓冲液3mL，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零。另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9mL，NADH溶液0.1mL，加盖摇匀后，测定340nm光吸收值（A）。取出比色杯加入经稀释的酶液10uL，立即即时，摇匀后，每隔0.2min测A340，连续测定3min，以A对时间作图，取反应zui初线性部分，计算每分钟A340减少值。加入酶液的稀释度应控制每分钟A340下降值在0.1～0.2之间。

注意事项

1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应贮存在零下20摄氏度冰箱。

2、酶液的稀释度及加入量应控制每分钟A340下降值在0.1～0.2之间，以减少实验误差。

3、NADH溶液应在临用前配制。