精子细胞氧化应激活性氧高质荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

精子细胞氧化应激活性氧（ROS）高质荧光检测试剂是一种旨在使用透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在细胞氧化条件下，产生荧光，来定量检测精子细胞内活性氧族的生成和增加的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于动物和人体精子细胞的活性氧族的检测。可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学，以及发育生物学（男性不育）等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简便，性能稳定，荧光清晰。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、*（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。其中精子细胞（spermatozoa）对于活性氧较为敏感：低浓度活性氧可以调节正常精子功能、精子获能、顶体反应、精卵融合等；高浓度活性氧则影响精子细胞的质量和功能，因为精子细胞质膜含有大量不饱和脂肪酸，胞浆含有少量的祛除活性氧的相关酶蛋白，由此活性氧容易造成精子质膜的流动性和DNA完整性受到损害，精子运动能力降低，不能参与授精活动，zui终导致特发性不育症（idiopathic infertility）。氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydro fluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydro fluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种*自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。一旦被*、过氧化基、过氧亚硝基阴离子等氧化，便产生荧光。据此测定精子细胞内活性氧族的浓度。 

产品内容

清理液（Reagent A）   毫升

染色液（Reagent B）   微升

稀释液（Reagent C）   毫升

保存液（Reagent D）        毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

2毫升离心管：用于样品操作的容器

细胞培养箱：用于样品孵育

微型台式离心机：用于样品操作

血细胞计数器：用于精子细胞计数

（共聚焦）荧光显微镜或：用于观察荧光精子细胞

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于精子细胞荧光定量分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

• 移取2毫升新鲜收集（1小时内）的精液到2毫升离心管
• 放进37℃培养箱孵育20分钟
• 放进微型台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀精子细胞颗粒群
• 放进台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入适量的清理液（Reagent A）
• 充分混匀后，在血细胞计数器上进行精子细胞计数
• 调整精子细胞数为1 X 10⁷/毫升
• （选择步骤）放进37℃培养箱里备用（1小时内）
• 放进微型台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液，轻柔混匀
• 放进37℃恒温水槽孵育40分钟，避免光照
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的xx微升保存液（Reagent D），轻柔混匀细胞颗粒群
• 放进冰槽里
• 选择下列方式之一进行操作：

• 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述精子细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片

2）激发波长490nm，散发波长530nm――

绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：

1）移取400微升上述精子细胞悬液到1毫升比色杯

2）加入xx微升保存液（Reagent D）

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪：激发波长490nm，散发波长530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时须戴手套
• 建议无菌操作，尤其不可污染母液
• 样品检测前，建议在血细胞计数器上进行精子细胞计数
• 精子细胞计数时乘上稀释倍数10⁴。标准血细胞计数器（Hemocytometer）的计算方法是：

1毫米方块的细胞计数X 10⁴（稀释倍数）＝实际细胞数/毫升

• 染色完成后，即刻进行检测分析，否则影响检测
• 本产品也可用于冻存精子细胞的检测分析
• 如果背景过深，调整染色工作液使用剂量（1：200至1：1000容量比），避免过度染色
• 本公司提供阳性对照甲萘醌溶液（GMS12041），观察细胞荧光增强现象
• 正常精子细胞活性氧阳性率较低，通常为小于4%
• 如果需要使用流式细胞仪分析，建议使用精子细胞氧化应激活性氧（ROS）细胞流式仪检测试剂盒—GMS14033
• 本公司提供系列发育生物学相关检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰

使用承诺

杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息

单组分订购信息

编号 名称 规格

GMS14036.1 精子细胞氧化应激活性氧高质荧光检测试剂盒 20次

GMS14036.1A 清理液（Reagent A） 毫升

GMS14036.1B 染色液（Reagent B） 微升

GMS14036.1C 稀释液（Reagent C） 毫升

GMS14036.1D 保存液（Reagent D） 毫升