细胞基质金属蛋白酶总活性荧光定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细胞基质金属蛋白酶（MMP）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针MCA供体和DAP/DNP受体双重标记的多肽底物PLGLAR，在蛋白酶的水解下，解离抑制基团，产生荧光产物，即采用荧光法来测定样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中基质金属蛋白酶（包括1、2、3、7、8、9、10、12、13、14等）的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。

保存方式

保存底物液（Reagent D）和标准液（Reagent E）在-20℃冰箱里；缓冲液（Reagent C）保存在室温下；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应孵育

黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备

 1． 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备 

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或纯化酶样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光酶标仪（温度为37℃）：激发波长330nm，散发波长400nm，间隔5分钟，读数6次（共30分钟）；增益倍数100至200

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

4． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

5． 分别加入xx微升缓冲液（Reagent C）到1至5号管

6． 移取xx微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀

7． 小心移取xx微升1号管稀释的标准液（Reagent E）到2号管，混匀

8． 小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent E）到3号管，混匀

9． 小心移取xx微升3号管稀释的标准液（Reagent E）到4号管，混匀

10． 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

三、荧光测定 

1． 在黑色96孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到相应孔里

3． 分别加入20微升上述配制的标准液或待测样品（20微克纯化酶或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）

4． 放进37℃培养箱里孵育10分钟

5． 分别加入xx微升底物液（Reagent D）

6． 轻轻摇动黑色96孔板

7． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位RFU；横座标（X轴）为标准甲氧基多肽浓度（微摩尔/升）

9． 标准样品实际荧光读数：标准样品值—背景对照值

10． 待测样品实际荧光读数：5分钟荧光读数—背景对照荧光读数

11． 根据标准曲线获得样品对应甲氧基多肽浓度（微摩尔/升）

12． 活性计算：

根据标准曲线获得样品对应甲氧基多肽浓度（微摩尔/升）X样品稀释倍数]÷ 5（反应时间；分钟）＝纳摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔/毫克/分钟