细胞膜流动性（fluidity）PDA荧光检测试剂盒产品说明书

主要用途

细胞膜流动性（fluidity）PDA荧光检测试剂是一种旨在通过苯并芘癸酸荧光染料，选择性地与细胞膜整合，并与之产生空间交互作用，形成激基缔合物，其荧光散发波长的转移，即荧光比值的增强或减弱，来分析膜流动性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种人体或动物贴壁或悬浮细胞膜流动性的动力学检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简易，性能稳定。

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离操作

*细胞培养液（GMS12052）：用于细胞脱落操作

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

微型台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光定性分析

比色皿或黑色96孔板：用于荧光定量分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析

细胞流式仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent B）和强化液（Reagent D）放进25℃恒温水槽里预热。然后分别移出10微升染色液（Reagent A）和10微升强化液（Reagent D）到新的1.5毫升离心管，加入980微升稀释液（Reagent B），混匀后，在冰槽里静置（共5次操作量），并标记为染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

一、直接法

1． 准备1个96孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约1 X 10⁵细胞数）

2． 小心抽去细胞培养液

3． 轻轻沿着孔壁加入200微升 清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4． 小心抽去清理液（Reagent C）

5． 加入200微升含有染色液（Reagent A）、稀释液（Reagent B）和强化液（Reagent D）的染色工作液，覆盖培养孔表面

6． 放进25℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）

7． 小心抽去染色工作液

8． 小心加入200微升清理液（Reagent C）

9． 小心抽去清理液（Reagent C）

10． 重复实验步骤8至9一次

11． 小心加入200微升清理液（Reagent C）

12． 选择下列检测：

一、 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察

1） 单体荧光（二向色性滤波器激发波长350nm，散发波长370nm，干涉滤波器405nm波长 ）――可见浅蓝色荧光；如果强度明显，表明膜流动性减弱

2） 激基缔合物（eximer）荧光（二向色性滤波器激发波长350nm，散发波长470nm）――可见深蓝色荧光；如果强度显著减弱，表明膜流动性减弱

二、即刻在荧光酶标仪检测（激发波长350nm，散发波长370nm和470nm）：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU）以及RFU470/RFU370的比值：比值高，膜流动性强

二、间接法

1． 准备1个12孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约2 X 10⁶细胞数）

2． 小心抽去细胞培养液

3． 加入1毫升 清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4． 小心抽去1毫升 清理液（Reagent C）

5． 加入500微升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养孔表面

6． 置入37℃培养箱1分种

7． 轻轻抖动培养板，使细胞脱落，然后加入1毫升用户自备的*细胞培养液

8． 移入1.5毫升离心管（注意：悬浮细胞从这一步开始）

9． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g

10． 小心抽去上清液

11． 加入200微升含有染色液（Reagent A）、稀释液（Reagent B）和强化液（Reagent D）的染色工作液

12． 用200微升枪头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群

13． 放进25℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）

14． 放进微型台式微型离心机离心5分钟，速度为1000g

15． 小心抽去上清液

16． 加入500微升清理液（Reagent C），混匀细胞颗粒群

17． 放进微型台式微型离心机离心5分钟，速度为1000g

18． 小心抽去上清液

19． 重复实验步骤16至18一次

20． 加入500微升清理液（Reagent C），混匀细胞颗粒群

21． 进行下列检测

选择一、（共聚焦）荧光显微镜观察 

1． 混匀后，移出50微升在载玻片上

2． 即刻进行载玻片压片，在荧光显微镜下进行观察：

1） 单体荧光（二向色性滤波器激发波长350nm，散发波长370nm，干涉滤波器405nm波长 ）――可见浅蓝色荧光；如果强度明显，表明膜流动性减弱

2）激基缔合物（eximer）荧光（二向色性滤波器激发波长350nm，散发波长470nm）――可见深蓝色荧光；如果强度显著减弱，表明膜流动性减弱

注意事项

1． 本产品为20次（0.2毫升工作液）操作

2． 操作时，须戴手套

3． 待测细胞建议不要过于饥饿或过度生长

4． 操作时，避免污染母液，尤其是稀释液（Reagent B）

5． 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析

6． 孵育时，避免光照

7． 本公司提供系列膜流动性检测试剂产品