组织CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

组织CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到CAMKII磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析组织裂解样品中CAMKII活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中CAMKII激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

产品内容

清理液（Reagent A）   60毫升

裂解液（Reagent B）   10毫升

缓冲液（Reagent C）    4毫升

酶促液（Reagent D）  500微升

反应液（Reagent E）  500微升

底物液（Reagent F）  500微升

阴性液（Reagent G）  500微升

产品说明书       1份 

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

CAMKII激酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

（微型）台式离心机：用于细胞预处理

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1． 手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （选择步骤）抽去清理液

5． 移入到一个液氮冻存管

6． 即刻放进液氮罐过夜

7． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

8． 放进一个15毫升锥形离心管

9． 加入置于冰槽里的100至500微升裂解液（Reagent B）（注意：可以调节蛋白浓度）

10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12． 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g

13． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

15． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

一、 背景对照测

1． 移取130微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入20微升反应液（Reagent E）

4． 加入20微升底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入10微升阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

二、 样品测定

1． 移取130微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入20微升反应液（Reagent E）

4． 加入20微升底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入10微升待测样品（注意：50微克组织裂解蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

五、 计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X 0.1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.005（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔NADH/分钟

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括背景操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液

5． 样品须澄清，至关重要 

6． 建议使用比色皿测定

7． 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定

8． 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟

9． 光度测定后，比色皿须清洗*

10． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性

11． 样本测定读数持续上升，表明酶活过低或样品量过低

12． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

13． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

14． 可以使用CAMKII抑制剂（KN-93；IC50=370纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照

15． Ca²⁺/钙调素依赖型蛋白激酶II活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

16． 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感