植物腺苷酸激酶活性酶连续循环反应光度法定量检测 试剂盒产品说明书

主要用途

植物腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶连续循环反应光度法定量检测试剂是一种旨在通过腺苷酸激酶、己糖激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶的酶连续循环反应系统下，伴随的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）还原反应后峰值的变化，即采用光度法来测定植物组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等腺苷酸激酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

DOUNCE匀浆器：用于组织匀化

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定500毫克组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎组织

5． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管

6． 加入预冷的xx毫升裂解液（Reagent B）

7． 涡旋震荡5秒，充分混匀

8． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）

9． 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为300g 

10． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管

11． （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为300g 

12． 即刻移入到1.5毫升离心管

13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

14． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零 

2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；缓冲液（Reagent C）室温下预热均衡；底物液（Reagent E）避免光照

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反应液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 在37℃温度下孵育3分钟

6． 加入xx微升阴性液（Reagent F）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（5分钟读数－0分钟读数）

四、 样品测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反应液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 在37℃温度下孵育3分钟

6． 加入20微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5分钟读数－0分钟读数） 

五、计算样品活性

六、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里

3． 分别加入xx微升反应液（Reagent D）

4． 分别加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 在37℃温度下孵育3分钟

6． 分别加入xx微升阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）

7． 轻轻摇动96孔板

8． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

9． 活性计算

注意事项

1． 本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 建议使用比色皿测定

5． 样品须澄清，至关重要 

6． 加样后3秒内光度测定

7． 测定值由低到高变化；测定可持续5分钟

8． 光度测定后，比色皿须清洗*

9． 样本测定5分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性

10． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12． 腺苷酸激酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.6条件下，每分钟内能够产生1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列经典细胞激酶检测试剂产品