细胞蛋白磷酸酶1（PP1）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细胞蛋白磷酸酶1（PP1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用使用特异性底物糖原磷酸化酶a，在PP2A抑制剂存在下，受到PP1去磷酸化后，释放出游离磷酸根，由硫酸亚铁氨还原产生钼蓝显色反应后峰值的变化，即采用比色法测定单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞裂解悬液样品包括免疫沉淀复合物和粗提或部分纯化酶样品的蛋白磷酸化酶1活性及其抑制剂的检测。广泛应用于细胞凋亡、蛋白组学、病理生理学变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

产品内容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）          毫升

缓冲液（Reagent C）        毫升

阴性液（Reagent D）          毫升

反应液（Reagent E）         微升

显色液（Reagent F）         毫升

标准液（Reagent G）         微升

产品说明书              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent E）和显色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；显色液（Reagent F）具有腐蚀性，避免直接用手接触；有效保证6月

用户自备

15毫升离心管：用于样品处理的容器

1.5毫升离心管：用于样品处理和保存的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于样品收集

培养箱：用于孵育反应物

平式摇荡仪：用于混匀反应物

500微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（5 X 10⁷细胞）

2． 小心加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞 

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． 移取2微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清）

2． 设定好分光光度仪或酶标仪（温度为37℃）：波长为660nm，并置零  

3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4． 按下表分别加入阴性液（Reagent D）和标准液（Reagent G）到每个离心管，混匀

5． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

三、 标准曲线测定

1． 移取200微升上述配制的标准液到新的比色皿

2． 在30℃温度下孵育10分钟

3． 加入xx微升显色液（Reagent F），混匀

4． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

5． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

6． 重复实验步骤1至5四次

1． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）

三、 样品背景测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待测样品（总量100微克细胞裂解萃取液蛋白；作为样品背景） 

3． 在30℃温度下孵育10分钟

4． 加入xx微升阴性液（Reagent D），混匀

5． 加入xx微升显色液（Reagent F），混匀

6． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

7． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

8． 根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度（微摩尔/升）

四、 样品活性测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待测样品（总量100微克细胞裂解萃取液蛋白） 

3． 在30℃温度下孵育2分钟

4． 加入xx微升反应液（Reagent E）

5． 在30℃温度下孵育10分钟

6． 加入xx微升阴性液（Reagent D），混匀

7． 加入xx微升显色液（Reagent F），混匀

8． 在37℃温度下孵育10分钟，避免光照

9． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

10． 根据标准曲线获得样品活性对应磷浓度（微摩尔/升）

五、 计算样品活性

七、酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：标准样品、样品背景、样品活性

2． 分别移取100微升上述配制的标准液到相应的标准样品孔里

3． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到样品背景和待测样品孔里

4． 分别加入10微升待测样品（总量100微克细胞裂解萃取液蛋白）到样品背景和样品活性孔里

5． 加入xx微升反应液（Reagent E）到样品活性孔里

6． 加入xx微升阴性液（Reagent D）到样品背景孔里

7． 在30℃温度下，置于平式摇荡仪孵育10分钟，速度为50RPM

8． 分别加入xx微升阴性液（Reagent D）到样品背景和待测样品孔里

9． 分别加入xx微升显色液（Reagent F）到所有孔里

10． 在37℃温度下，置于平式摇荡仪孵育10分钟，速度为50RPM，避免光照

11． 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数

12． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）

13． 根据标准曲线获得样品对应磷浓度（微摩尔/升）

14． 计算样品活性

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括5次（点）标准测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准曲线测定只需1条

4． 显色液（Reagent F）具有腐蚀性，避免直接用手接触

5． 样品切忌使用磷酸缓冲液、EDTA、EGTA和脱氧胆酸纳处理

6． 比色测定后，比色皿须清洗

7． 如果用户没有660nm波长，可以使用600至660nm的任一波长替代

8． 吸光读数增高，表明具有酶活性

9． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量； （本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

10． 蛋白磷酸酶1活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.4的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）释放1微摩尔的磷

11． 本公司提供系列磷酸化酶检测试剂产品