考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

一、目的

学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。

二、原理

    考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）法测定蛋白质含量属于染料结合法。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，zui大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，该结合物在595nm波长下有zui大光吸收。在一定蛋白质浓度范围内（0～1000ug/mL），其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质于考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年由Bradford建立的，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质的含量，是一种常用的对微量蛋白质进行快速测定的方法。

三、实验用品

1. 实验材料：新鲜绿豆芽。
2. 器皿：

（1）、分析天平、台式天平。

（2）、分光光度计。

（3）、离心机。

（4）、研钵1套。

（5）、离心管：10mL×1。

（6）、刻度试管：10mL×1或量筒：10mL×1。

（7）、移液管：5mL×1 , 2mL×1，1mL×2，0.1mL× 3.

（8）、试管：10mL× 14，试管架，洗耳球。

3、试剂

（1）、牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000ug/mL的标准蛋白质溶液。

(2)、考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%的乙醇中，加入85%（m/V）的磷酸100mL，zui后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。

四、操作步骤

1、标准曲线制作

（1）、0～100ug/mL标准曲线的制作；取6支10mL的试管加入试剂，配制不同浓度的蛋白质标准液。

另取6支15mL的试管，从上述各试管中分别吸取0.1mL溶液，加入5mL考马斯亮蓝G-250，充分混匀，放置2min后用1cm光径的比色杯在595nm波长下比色，记录各试管测定的光密度值并作标准曲线。

（2）、0～1000ug/mL标准曲线的制作

取6支10mL的试管，加入试剂。

其余步骤同操作步骤1，作出蛋白质浓度为0～1000ug/mL的标准曲线。

2、样品提取液中蛋白质浓度的测定

（1）、待测样品制备

称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5～1b以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL的刻度试管，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

（2）、测定

另取2支10mL的试管，分别吸取样品提取液0.1mL（至少重复一次），加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径的比色杯在595nm下比色，记录各管测定的光密度值，并通过过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（ug）。以标准曲线1号试管做空白。

五、附注

1. 考马斯亮蓝G-250法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2. 有些阳离子和有机溶剂存在时不干扰测定，但大量的去污剂存在时会严重干扰测定。
3. 蛋白质于考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，反应在2min左右达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。