PCR-ELISA原理及操作

PCR-ELISA原理及操作

PCR-ELISA是一种将PCR性与ELISA高特异性结合在一起的转基因检测方法。利用共价交联在PCR管壁上的寡核苷酸作为固相引物，在Taq酶作用下，以目标核酸为模板进行扩增，产物一部分交联在管壁上成为固相产物，一部分游离于液体中成为也想产物。对于固相产物，可用标记探针与之杂交，再用碱性磷酸酯酶标记的链亲合素进行ELISA检测，同时可通过凝胶电泳对液相产物进行分析。

1. 固相引物的包被 固相引物的包被时指利用特殊试剂将5`磷酸化或氨基化的引物特异性地固定在附着物上，它是故乡扩增的前提，也是杂交检测的基础。附着物的种类很多，如消化纤维、尼龙膜、聚苯乙烯等。我们用处理过的PCR管壁充当附着物，目的是方便随后的PCR扩增。Gilham认为，理想的固定是DNA分子的单一位点共价固定在附着物上，他利用碳二亚胺将5`端磷酸化的DNA分子固定在纸上，宝贝上的DNA分子可以通过同位素标记探针进行定量，通常有20-50ng的核酸分子可以吸附到管壁上，这样1-2nm长的引物就排列在管壁上。一般来说，吸附在管壁上的寡核苷酸大约有35-50ng，高浓度的寡核苷酸并不能提高吸附量。包被的效果与温度、时间、核酸分子的浓度以及缓冲液的种类和PH值等有关。

EDC在包被过程中起到桥梁作用，它以共价键的形成与固相引物的磷酸基团结和，激活寡核苷酸。EDC溶于水后极不稳定，活化后的寡核苷酸半衰期很短，这个操作带来不便。如果先加寡核苷酸混合物中加入甲基咪唑会解决不稳定的现象，火花的寡核苷酸即使过ye也不会影响结果。EDC极易吸潮，必须干燥贮存于-20℃，分成等份，没分用于一次包被

EDC的浓度对包被效果有较大影响，zui适浓度为10mmol/L.5-12.5mml/L之间没有太大的差异。EDC的浓度增加到16mmol/L时，包被上的寡核苷酸的量急剧下降，增加到100mmol/L后，几乎检测不到引物。

大量实验证明，*包被条件为10mmol/L的甲基咪唑，10mmol/LEDC，ph7.0，50℃反应5h，核酸的浓度一般为100mmol/L，高浓度的核酸只能稍微缩短反应时间而不能提高结合上的分子的量。包被好的PCR管可在4℃或更低温度下存放半年以上。

PCR扩增  在包被寡核苷酸的管内进行PCR扩增，扩增和条件因目的片段而异，对35S启动子和NOS终止子，PCR反应体系为：10倍缓冲液5ul，25mmol/L Mg2 4ul，10mmol/LdNTPs 1ul，25umol/L引物11ul，8umol/L引物2（固相引物）1ul,Taq酶2u，加水至50ul。固相引物与液相引物的浓度比值决定了两种产物的量，1:1利于琼脂糖凝胶电泳检测，8:1利于杂交检测，同时也适合凝胶电泳分析。35S启动子和NoS终止子的扩增条件如下：94℃5min，54℃55s,72℃1min，1个循环：94℃30s，72℃30s，35个循环：72℃延伸8min。NPTII的退火温度为50℃，其他条件同上。

ELISA检测  变形后的固相产物在5倍SSC（含0.5%BR）中杂交1h，杂交温度因探针而异，一般在45-50℃都能得到较好的效果，杂交后用0.5倍SSC，0.1%吐温-20洗掉非特异性结合的探针，加入100ulLAP（1:2500）使之与探针上的地gao辛结合，10mg/mL的PNPP显色30min后，通过酶标仪读数。去掉空白对照，高于10为阳性，低于0.1为阴性。

PCR-ELISA的又定

1 高灵敏度 2 可靠性  3半定量检测