L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶活性测定试剂盒说明书

L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（L-galacto,4-lactone dehydrogenase，

Gal LDH）活性测定试剂盒说明书

分光光度法

50管/48样

注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

L-半乳糖途径是合成 AsA的主要途径。Gal   LDH位于线粒体内膜，负责催化植物体内 AsA

生物合成的zui后一步，也是该途径的关键酶之一，对植物体内 AsA含量的积累起着至关重

要的作用。

测定原理：

Gal LDH催化 L-半乳糖内酯还原细胞色素 c（Cyt c），还原型Cyt c在  550nm有吸收峰；测

定还原型 Cyt c增加速率，来计算Gal LDH活性。

自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入40mL蒸馏水，充分溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL

试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

Gal LDH测定操作：

1.分光光度计预热30 min，调节波长到550nm，蒸馏水调零。

2.试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3.依次在 1mL玻璃比色皿中加入 100μL上清液、800μL预热的试剂二和100μL试剂三，迅

速混匀后于 550nm比色，记录10s和130s的吸光值A1和A2，△A=A2﹣A1。

Gal LDH活性计算公式：

(1).按蛋白浓度计算

Gal LDH活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。

Gal LDH (μmol/min/mg prot) =△A÷ε÷d×V反总×106÷（Cpr×V样）÷T

=289×△A ÷Cpr

(2).按样本质量计算

Gal LDH活性单位定义：25℃中每克样品每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。

Gal LDH (μmol/min/g鲜重)  =△A÷ε÷d×V反总×10⁶÷（W×V样÷V样总）÷T

=289×△A ÷W

ε：还原型 Cyt c摩尔消光系数，17.3×10³L/  mol/cm；d：比色皿光径(cm)，1cm；V反总：反

应体系总体积，1mL=0.001 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V样：加入反应体系中上清液体积，

100μL=0.1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公

司蛋白质含量 BCA试剂盒；V样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应

时间，2min。

注意事项:

试剂二和试剂三配制好后 3天内使用完。