α-酮戊二酸脱氢酶活性测定试剂盒说明书

α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性测定试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

测定意义

α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。

测定原理

α-KGDH 催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和辅酶 A 生成琥珀酰辅酶 A、二氧化碳和 NADH，NADH在 340 nm 有特征吸收峰，以 NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：50mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：1mL×1 支，-20℃保存；试剂四：液体 55.5mL×1 瓶，4℃保存；试剂五：粉剂×1 支，4℃保存；试剂六：粉剂×1 支，4℃保存；试剂七：粉剂×1 支，4℃保存;试剂八：粉剂×1 支，4℃保存;试剂九：粉剂×1 支，-20℃保存;

试剂十：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 2.1mL 蒸馏水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃保存。

工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七、试剂八和试剂九转移到试剂四中混合溶解待用。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH（此步可选做）。

5、在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体α-KGDH 活性测定。

测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm 处，蒸馏水调零。

2、工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。

3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 40μL 试剂十、60μL 样本和 1.1mL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 的吸光值 A1 和 2min20s 时的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

α-KGDH 活性计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

α-KGDH 活性（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

α-KGDH（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

α-KGDH 活性（U/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.65×ΔA V 反总：反应体系总体积，1.2×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：

比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。